可多次交换的无标记定点整合转基因系统及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域。具体地，本发明涉及可多次交换的无标记定点整合转 基因系统及其应用，更具体地，涉及转基因系统、转基因动物细胞及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 非人转基因动物能够作为筛选和鉴定药物的理想模型，从而可W用于研究基因功 能，为人类探讨疾病发病机理，寻求有效治疗途径，也可W用于动物遗传品质改良的研究。 转基因动物研究蕴含着巨大的经济价值，具有非常广阔的应用前景，目前在国际上成为生 物工程的投资热点之一，也推动了转基因技术研究的发展。
[0003] 当前，动物转基因技术应用十分广泛，多个物种的转基因个体制备已较为成熟，用 于基础研究、生物医学W及农业应用等方面的各种转基因品系也日益丰富，特别是品系繁 多的转基因小鼠，为生物医药和基因生理功能研究提供了坚实基础。尽管如此，动物转基因 技术的应用尚存在效率、安全W及稳定性的问题，特别是家畜动物转基因，效率低下、制备 周期长、遗传不稳定、品系培育周期长、代价高。
[0004] 因而，现阶段的动物转基因技术仍有待改进。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种简单、快捷、高效的无标记定点整合转基因技术。
[0006] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0007] 发明人发现，目前的动物转基因技术，效率低下、制备周期长、遗传不稳定、品系培 育周期长、代价高，具体原因主要有：一方面，表达、遗传不稳定，难W获得表型明显的转基 因动物；另一方面，受抗性基因或其他标记因素的影响，即使制备出表型明显的转基因动 物，仍然难W推广。因而，发明人认为，如果W无标记、定点整合技术为基础制备转基因动 物，不仅可W提高转基因效率和遗传的稳定性，为今后品系的培育奠定坚实的基础，同时， 也有助于消除公众恐慌，加快转基因技术及其产品的产业化进程。因此，不论从社会需求还 是经济需求方面考虑，无标记定点整合转基因技术的研究都有着重大的价值。
[0008] 另外，整合酶介导的定点整合外源基因系统的发展过程中，科学家陆续发现了哺 乳动物基因组的"友好"位点，即可使外源基因在基因组中高效表达并稳定遗传的位点。基 因组的友好位点主要有四类：逆转录病毒/慢病毒整合位点，腺病毒整合位点，转座子位 点，OC31整合酶识别的假attp位点。其中，R0SA26位点起源于逆转录病毒转小鼠ES细 胞的基因捕获扫描，插入该位点的基因可广泛表达于胚胎发育的各个时期W及各种组织， 是在小鼠发现的第一个高效表达外源基因的友好位点。自发现W来，该位点整合表达过多 种基因，现在已成为小鼠ES细胞系中标准的转基因位点。在人的ES细胞系，Irion等根据 小鼠R0SA26同源性也发现了人的R0SA26位点，并用无启动子RFP验证了该位点的有效性。 家畜动物有些物种基因组分析结果也已经确定R0SA26位点，但至今仍无任何该位点整合 基因的报道。
[0009] 而本发明整合TALEN、RMCE等多项技术，能够实现外源基因在动物尤其是家畜动 物基因组上的定点插入，且不含任何抗性标记基因，可W稳定遗传到下一代，是安全、高效、 稳定遗传的转基因动物制备技术。具体地：
[0010] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种转基因系统。根据本发明的实施例，该 系统包括；第一构建体，所述第一构建体为TALEN载体，所述TALEN载体识别并剪切友好位 点序列；第二构建体，所述第二构建体包含左同源臂、右同源臂、筛选标记表达框和第一整 合酶识别序列loxp和10x2272,所述筛选标记表达框位于所述左同源臂和所述右同源臂之 间，所述loxp位于所述左同源臂下游，所述10x2272位于所述右同源臂上游；第H构建体， 所述第H构建体包含目的外源基因和第二整合酶识别序列loxp'和10x2272'，所述目的外 源基因位于所述loxp'和所述10x2272'之间；W及第四构建体，所述第四构建体包含整合 酶基因表达框。
[0011] 发明人惊奇地发现，利用本发明的转基因系统能够简单、快捷、高效地实现目的外 源基因在动物尤其是家畜动物基因组上的定点插入，且制备获得的转基因动物细胞甚至转 基因动物个体不含任何抗性标记基因，制备周期短、安全可靠，目的外源基因能够稳定遗传 到下一代。
[0012] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种制备转基因动物细胞的方法。根据 本发明的实施例，该方法利用前面所述的转基因系统进行转基因。由此，利用该方法能够 简单、快捷、高效地实现目的外源基因在动物尤其是家畜动物基因组上的定点插入，有效地 制备获得不含任何抗性标记基因的转基因动物细胞甚至转基因动物个体，且该方法操作简 单、制备周期短、可重复性好，安全高效，目的外源基因能够稳定遗传到下一代，进而用于品 系培育或动物模型培养时，所需周期短、代价小。
[0013] 根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种转基因动物细胞。根据本发明的实 施例，该转基因动物细胞是通过前面所述的制备转基因动物细胞的方法制备获得的。根据 本发明的实施例，该转基因动物细胞不含任何抗性标记基因，安全高效，并且其所包含的外 源基因能够稳定遗传，因而能够有效用于进行品系培育或动物模型培养。
[0014] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0015] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中：
[0016] 图1是根据本发明一个实施例的制备转基因动物细胞的方法的流程示意图；
[0017] 图2是根据本发明一个实施例的第一构建体TALEN1载体和TALAN2载体的结构示 意图，其中RVDs是TALEN的模块排列顺序；
[0018] 图3是根据本发明一个实施例的第一构建体TALEN1载体和TALEN2载体的电泳检 测结果图，其中，
[0019] 图3a是TALEN载体箇液PCR结果，
[0020] 图3b是第一构建体的质粒和酶切鉴定电泳图；
[0021] 图4是根据本发明一个实施例的第一构建体的活性鉴定结果；
[0022] 图5是根据本发明一个实施例的第二构建体的结构示意图；
[0023]图6是根据本发明一个实施例的PR26打祀载体的各元件PCR扩增产物电泳结果， W及终载体质粒和酶切鉴定结果，其中，
[0024]图6a是打祀载体构建所需元件的PCR扩增结果，
[00巧]图化是打祀载体质粒和化el酶切鉴定结果；
[0026] 图7是根据本发明一个实施例的pR26打祀细胞克隆鉴定结果；
[0027] 图8是根据本发明一个实施例的pR26打祀细胞克隆鉴定结果；
[0028]图9是根据本发明一个实施例的第H构建体的结构示意图；
[0029] 图10是根据本发明一个实施例的第H构建体构建过程中的电泳检测结果图，其 中，
[0030]图 10a是骨架载体loxp-mcs-lox2272-T菌液PCR结果，
[0031] 图10b是骨架载体酶切及目的片段酶切结果，
[0032] 图10c是第H构建体酶切鉴定结果；
[0033]图11是根据本发明一个实施例的第四构建体的结构示意图；
[0034] 图12是根据本发明一个实施例的第四构建体构建过程中的电泳检测结果图；W 及
[003引图13是根据本发明一个实施例的EGFP定点整合的PCR验证结果图。
【具体实施方式】
[0036] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考 附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0037] 需要说明的是，术语"第一"、"第二"仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相 对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有"第一"、"第二"的特征可 W明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说 明，"多个"的含义是两个或两个W上。
[0038] 首先，需要说明的是，在本发明中所使用的术语"构建体"是指该样的一种遗传载 体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列（即目的外源基因）转入宿主细胞中，使 目的核酸序列整合到宿主细胞的基因组上，W获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建 体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可W为质粒、瞻菌体、人工染色体、粘粒 (Cosmid)、病毒的至少一种。根据本发明的具体示例，构建体呈质粒的形式。质粒作为遗传 载体，具有操作简单，可W携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别 限制，既可W是环形质粒，也可W是线性质粒，即可W是单链的，也可W是双链的。本领域技 术人员可W根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语"核酸"可W是任何包含脱氧核 糖核巧酸或者核糖核巧酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其 长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为D