一种茄子单粒种子dna快速提取用于杂交种纯度鉴定的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物育种技术领域，具体涉及一种茄子单粒种子DNA快速提取用于杂 交种纯度鉴定的新方法。
【背景技术】
[0002] 与常规种比较，茄子杂交种具有高产、抗逆和优质等诸多方面的优势。但茄子为严 格自花授粉作物，在杂交制种过程中，由于去雄不及时或去雄不完全，往往产生自交种子， 给生产造成损失。因此，及时进行杂交种纯度检测非常重要。目前，主要方法有： 田间检测：此方法目前为多数茄子种子生产单位选用。茄子苗龄50-60天，定植后 40-50天始收，整个鉴定期100天以上，耗时长。得到鉴定结果后往往已错过当年播种期，导 致库存压力增大，种子芽势降低。
[0003] 室内DNA检测：目前有R APD、SRAP、SSR标记法对茄子进行纯度检测，但都是采取 叶片，通过传统CTAB提取法DNA。茄子出苗慢，从播种到第一片真叶展开大约30左右，研磨 一个样品至少要30秒，纯度鉴定至少要求群体在100株以上。刘军利用NaOH裂解法提取 茄子种嫩芽DNA进行品种纯度鉴定，提取的DNA中蛋白质和杂质含量较高，琼脂糖电泳并不 能看到明显的DNA条带，而且提取的DNA中有2%-4%的样本不能正常扩增，导致条带缺失， 而茄子发芽也至少需要5-7天。经检索，目前尚未发现通过提取单粒茄子种子DNA快速实 现杂交种纯度鉴定的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明公开了一种茄子单粒种子DNA快速提取用于杂交种纯度鉴定的方法，其特 征在于下如下的步骤进行： 1)杂交种母本和父本种子各1粒，F1代100粒饱满健康有活力的种子用于DNA提取； 包括：圆丰园单粒种子、茄子杂交种46-2012单粒种子、茄子杂交种紫帅四号单粒种子。
[0005] 2)将每粒种子分别装入2mL圆头离心管，内置两颗2mm直径钢珠，液氮速冻15-60 秒，采用高通量组织研磨器破碎，参数设定频率为45-100赫兹、时间为30-70秒； 3) DNA提取过程中65°C水浴10_60min，每隔3-8min混匀一次； 4) 采用苯酚抽提和体积比为24:1的氯仿异戊醇抽提，颠倒混匀次数80-100次， 12000rpm转速，离心时间4-10分钟；其中苯酚用量为450ul;优选颠倒混匀次数为80-100 次。
[0006] 5)取上清200uL，加入等体积异丙醇之前加入20uL3M乙酸钠促进DNA沉淀纯 化； 6) 70% (w/w)乙醇洗沉淀两次，种子DNA量少，洗时尽量避免将DNA沉淀倒掉，留10uL底液室温晾干至无酒精味。
[0007] 7)加入 20ulddH20 后 65°C保温 15min，混匀，3000rpm转速离心 20-60 秒。
[0008] 8)取2uLDNA采用天津科润蔬菜研宄所茄子研宄室自有SSR鉴定体系对杂种F1代 进行品种纯度鉴定。
[0009] 本发明采用杂交种母本和父本各1粒（有市售）、茄子F1代100粒饱满健康有活 力的种子用于DNA提取。将不做任何处理的种子分别装入2mL圆头离心管，内置两颗2mm 直径钢珠，液氮速冻30秒后，采用破碎仪破碎，参数设定为65Hz、70s。破碎后用连续加样器 每管添加600uL裂解液65°C温浴30分钟后通过氯仿异戊醇分离得到DNA样品。（氯仿：异 戊醇的体积比为24:1)经过核酸蛋白仪测定浓度后统一调整为50ng/uL，取2uLDNA采用已 知SSR鉴定体系对杂种F1代进行品种纯度鉴定。
[0010] 本发明检测方法的检测对象为茄子F1杂交种。
[0011] 本发明首次实现了对茄子种子DNA直接进行提取的目标。采用一台高通量组织研 磨器(宁波新芝Scientz-48)可在70秒内完成48个样品的研磨，大大缩短研磨时间，比过 去研磨效率至少提高20倍。在改良CTAB法的基础上，通过增加颠倒混匀次数(从20次增 加到100次)、添加3M乙酸钠、最后洗涤时留少许乙醇使其自然蒸发晾干等措施，在单粒种 子中提取到了质量稳定、数量充足的DNA质量，利用自有SSR纯度鉴定体系可在5个小时内 完成茄子杂种纯度鉴定。
[0012] 本发明的原理在于： 小样品提取到足够的DNA，在研磨方法，水浴过程中间隔混匀多次，苯酚抽提，颠倒混匀 次数从20次增加到100次，添加3M乙酸钠，离心时间从4分钟增加到10分钟，以及进行 PCR时间有调整，具体的内容如下： 采用机械研磨的方法研磨充分，可以更好破碎茄子种子的组织和细胞，由于种子细 胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类）对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲 液中需加入强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。十六烷基三甲基溴化铵 (hexadyltrimethylammomumbromide，简称为CTAB)是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜 和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。离心管添加CTAB水浴过程中每隔 5min混匀一次，目的是使药品与种子组织和细胞充分接触，尽量实现完全反应。再加入苯 酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸（DNA、RNA)水溶性很强， 经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。离心管加入苯酚后要剧烈颠倒摇 匀100次以上，为的是将除核蛋白之外的其余蛋白杂质溶解在苯酚有机相中，减少对DNA提 取的影响。离心管加入等体积的氯仿/异戊醇（24 : 1)轻轻颠倒摇匀100次以上，因为此 时DNA已经与核蛋白分离，DNA较脆弱，如果剧烈摇动会导致DNA断裂，影响提取效果。摇 匀100次以上为的是充分分离DNA，提高DNA提取质量。取上清200uL，加入20uL3M乙酸 钠可以促进DNA沉淀纯化。3M的醋酸钠有H20分子的作用，促进DNA沉淀，PH4. 8的醋酸钠 溶液降低了反应混合物中的pH值，起到中和作用，从而染色体DNA复性，并聚集成不可溶的 网络状聚合物。同时高浓度的醋酸钠亦会引起蛋白质-SDS复合物和高分子量的RNA分子 发生沉淀。通过离心处理，便可把网络状的DNA聚合物同变性的蛋白质-DNA及RNA等以复 合物形式沉淀出来，从而使DNA得到纯化。再加入220uL异丙醇即可将DNA完全沉淀，沉淀 DNA溶于20uLddH20中，65°C保温15min，使DNA得到充分溶解，得到总DNA溶液。防止DNA 量少而出现降解，应该立刻进行PCR扩增，或者-20°C保存。
[0013] 本发明公开的基于茄子单粒种子DNA快速提取用于杂交茄子品种纯度鉴定的方 法与现有技术相比所具有的积极效果在于： (1)检测速度快：以种子为材料提取DNA可以不受采样时间、地点的限制，也解除了提 取DNA过程中需要液氮研磨的麻烦。通过采用高通量组织研磨器(宁波新芝Scientz-48) 可在70秒内完成48个样品的研磨，大大缩短研磨时间，比过去研磨效率至少提高20倍。
[0014] (2)成本低：由于DNA提取工作量大大降低，节省人力物力，利用分子标记技术鉴 定一个品种纯度，仅需要500元左右，是所有技术中成本最低的。
[0015] (3)提取充分，结果可靠：实验证实，利用本方法提取DNA，速度快，质量高，每粒种 子提取的DNA可供3次电泳，而且条带清晰，纯度鉴定结果与田间纯度鉴定结果吻合。
[0016]
【附图说明】： 图1为圆丰园SSR琼脂糖凝胶电泳； 图2为杂交种46-2012聚丙烯凝胶电泳； 图3为紫帅四号SSR聚丙烯凝胶电泳。
【具体实施方式】
[0017] 为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅 仅是解释、而不是限制本发明的范围。需要特别说明是：本发明所用到的杂交种母本和父本 来源于包括：圆丰园单粒种子、茄子杂交种46-2012单粒种子、茄子杂交种紫帅四号单粒种 子均由市售。
[0018] 实施例1 前子杂交种圆丰园单粒种子DNA快速提取用于品种纯度鉴定DNA提取 1、将待测茄子品种圆丰园的母本和父本种子各1粒，匕种子100粒分别装入事先放 好两颗2mm直径钢珠的2ml圆底离心管中，分三批置于高通量组织研磨机48孔托盘，采用 65Hz频率研磨70s后成均匀粉末状，非常适合大批量DNA样品快速提取。用连续加样器分 别给每个离心管加入600uL65°C预热的2XCTAB提取缓冲液(包括0. 1%巯基乙醇)，放置在 离心管架后在水浴锅中65°C水浴30min，每隔5min混匀一次。30min后取出离心管放置在 高速离心机，参数设定为12000rpm离心lOmin。
[0019] 2、打开2mL离心管盖，用lOOOuL移液器取上清液450uL，加入事先预添加450uL苯 酚溶液的1. 5mL离心管中，盖上盖放入102孔离心管架后剧烈颠倒摇匀100次以上，12000 rpm离心10min。注意：加入苯酷（450ul)时，应在通风口或通风橱里面操作，且在加入苯 酚过程中，取水相下面的苯酚溶液而不能取上层溶液。
[0020] 3、取350ul上清(有时取下液，看环境温度。总之取水相)，加入等体积的氯仿/异 戊醇（24 : 1)(通风口或通风橱里面操作)，轻轻颠倒摇匀100次以上，12000rpm离心10 min〇
[0021] 4、取上清（200ul)转入新的1. 5ml离心管中，加入1/10体积3M乙酸钠，混匀， 加入等体积的一 20°C预冷的异丙醇，混匀，-20°C静置2小时以上。注意：遵循宁愿少取上 清也不要吸到下层氯仿的原则。
[0022] 5、离心（10000rpm, 10min)，弃上清，加入1ml70%乙醇洗沉淀两次(注意：由于 种子DNA量少，所以洗的时候不要将DNA沉淀倒掉)，室温晾干至无酒精味。
[0023] 6、加入20ulddH20后65°C保温15min，混匀，离心。注意：溶解后的DNA经过核酸 蛋白仪浓度检测后统一调整为50ng/uL，立刻进行PCR扩增，防止由于DNA