br>[0155] 所述phn操纵子编码所述碳-磷裂解酶复合物。非常大量的阅读绘图至编码磷酸 酯（盐）代谢转录调节子的phnF基因。在这个基因中的插入在编码碳-磷裂解酶复合物的 相同操纵子（phnA-P)中紧邻所述phnG基因和其它基因的上游。该复合物断裂碳-磷键， 其同样存在于磷霉素，而其断裂会导致磷霉素失活。大量的阅读也绘图至编码磷酸盐（酯） ABC-转运体底物结合蛋白的所述phnD基因的3' -半部分（3' -half)，以及紧邻编码磷酸酯 (盐）ABC转运体通透酶蛋白的phnE基因上游。
[0156] 所述uhpT基因编码磷酸己糖转运体（hexosephosphatetransporter)，一种主要 负责将磷霉素转运到所述细菌细胞内的基因产物。在这个基因中存在主要的插入点，其中 观察到了大量的转座子，这些转座子会造成基因破坏，阻碍有活力的转运体蛋白的生产。
[0157] 实施例2 :表现出在工业废弃物中牛长改善的突夺体沼泽红假单孢菌的牛产
[0158] 沼泽红假单孢菌是紫色光合作用细菌，其属于a_变形细菌。它具有非凡的代谢 多功能性，通过四种支撑生命的代谢模式中任何一种进行生长：光合自养和光合成（能量 来自光而碳来自二氧化碳），光合异养（能量来自光而碳来自有机化合物），化学异养（碳 和能量来自有机化合物）和化学自养（能量来自无机化合物而碳来自二氧化碳）。这种代 谢灵活性有助于这种细菌应用于生物技术应用中，包括工业废物的生物治理。
[0159] 电感#杰沼泽红假单孢菌的制各
[0160] 用于转座子诱变的电感受态细胞通过用从冷冻原液快速移出（streak)的沼泽红 假单孢菌菌落接种500mL酵母蛋白胨葡萄糖（YeastPeptoneDextrose) (YPD)肉汤而制 备。该培养物在光存在下轻轻振荡30°C温育过夜，以确保所述培养物保持分散。1LYH)用 10mL所述过夜培养物接种，并30°C培养，直至600nm波长下测得的光密度为0. 3。细胞通过 离心收获并再悬浮于10%甘油中。细胞通过离心取回并再次重新悬浮于10%甘油中。重 复此步骤，直到所述细胞已经总共洗涤五次。细胞用体积为所述起始培养物体积1/100的 甘油再悬浮。
[0161] 沼泽红假单孢菌转座子突夺体集合的牛成
[0162] 50yL电感受态细胞与lyL转座体混合，随后采用"GeneIIpulser"(Biorad)进 行电穿孔。按照常规，使用具有2mm电极间隙的电穿孔比色杯，电穿孔设置为2.OkV，25yF 和200D。随后向所述比色杯中加入lmLYPD，并在混合后，将所得到的细胞悬浮液转移至 新管中并在30°C下温育lh。所述细胞悬浮液随后涂布于YH)琼脂平板上（含有适当浓度 的庆大霉素），并将所述琼脂平板于30°C下温育以允许源于所述转座子转位到所述细菌基 因组中的庆大霉素抗性菌落生长。菌落然后从琼脂平板上通过重新悬浮于YH)肉汤中而收 获。随后加入甘油至15%的浓度，并将所述悬浮液分成等分部分在-80°C下贮存。
[0163] 生成使用表1中所示三种启动子的沼泽红假单胞菌转座子突变体集合用来研宄 在工业废弃物（污染的甘油）中在光存在和不存在下（分别为图中的子图A和B)的生长。 如图4中所示，产生的沼泽红假单胞菌突变体在清洁的和脏的甘油中，在化养和光养的代 谢模式下，都表现出生长改善。
[0164] 这些数据表明，显著更好地适应于工业废弃物（脏甘油）中生长的沼泽红假单胞 菌突变体形式通过本发明的方法可以很容易设计（工程化，engineered)和选择。
[0165] 等效物
[0166] 前面的描述详细介绍了本发明目前优选的实施方式。当考虑到这些描述时，预期 本领域技术人员就会想到其实践中的许多修改和变体。这些修改和变体预想都涵盖于所附 的权利要求之内。
【主权项】
1. 一种在选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长的突变体细菌的生产方法， 所述方法包括以下步骤： (a) 通过采用活化转座子（TnA)的转座子诱变生产突变体细菌集合，其中所述1^包含 能够增加其插入位点处或附近基因转录的启动子； (b) 在所述选择的生长条件下和在一种或多种参照条件下由突变体集合生长细菌从而 产生两种以上测试培养物；和 (c) 比较测试培养物之间TnA插入的分布以识别出在所述选择的生长条件下不利于生 长和/或存活的第一类基因和在所述选择的生长条件下有利于生长和/或存活的第二类基 因。2. 根据权利要求1所述的方法，进一步包括提供其中至少一种所述不利基因被去除或 破坏和/或至少一种所述有利基因过表达的设计的突变体细菌的步骤，使得所述突变体细 菌在所述选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长。3. 根据权利要求2所述的方法，其中多种所述不利基因被去除或破坏。4. 根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中多种所述有利基因过表达。5. 根据权利要求2-4中任一项所述的方法，进一步包括培养所述设计的突变体细菌并 随后对所述设计的突变体细菌实施权利要求1的步骤（a)-(c)以识别出在所述选择的生长 条件下不利于生长和/或存活的另外的第一类基因和在所述选择的生长条件下有利于生 长和/或存活的另外的第二类基因。6. 根据权利要求5所述的方法，进一步包括提供其中至少一种所述另外的不利基因被 去除或破坏和/或至少一种所述另外的有利基因过表达的第二轮设计的突变体细菌的步 骤，从而相对于权利要求2所述的设计的突变体细菌在所述选择的生长条件下所述突变体 细菌表现出改善的存活和/或生长。7. 根据权利要求6所述的方法，包括一个或多个另外轮的诱变并重复实施权利要求1 所述的步骤（a)-(c)以提供相对于前一轮的设计的突变体细菌在所述环境挑战存在下表 现出改善的存活和/或生长的第三或更多轮突变体细菌。8. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不利基因的去除和/或破坏包括 基因组最小化。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述基因组最小化包括将质粒DNA整合至细菌染 色体中并随后解离共合体。10. 根据权利要求8所述的方法，其中所述基因组最小化包括在线性DNA末端通过短同 源臂介导的同源重组。11. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括将至少一种异源基因引入到 所述细菌中的步骤。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述异源基因有利于在所述选择的生长条件下 生长和/或存活。13. 根据权利要求11或权利要求12所述的方法，包括将异源基因簇引入到所述细菌中 的步骤。14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述异源基因簇编码生物合成路径。15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述生物合成路径产生次级代谢产物。16. 根据权利要求13所述的方法，其中所述异源基因簇编码生物降解路径。17. 根据权利要求11所述的方法，其中所述异源基因编码治疗性蛋白。18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗性蛋白选自： (a) 酶； (b) 抗体； (c) 抗原； (d) 毒素； (e) 配体结合蛋白； (f) 抗生素； (g) 肽；和 (h) 细胞因子。19. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述选择的生长条件包括存在以下 各项： (a) 环境污染物； (b) 工业废弃产品； (c) 医疗废弃产品； (d) 药物或候选药物； (e) 选择的碳源，例如烃； (f) 一种或多种其它生物，例如微生物和病毒。20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述一种或多种其它生物选自： (a) 人类病原体； (b) 动物病原体；和 (c) 植物病原体。21. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述突变体细菌集合包含至少 0. 5XIO5个突变体，例如至少IX10 5个突变体。22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述突变体细菌集合包含至少5X10 5个突变 体。23. 根据权利要求21所述的方法，其中所述突变体细菌集合包含至少IX10 6个突变 体。24. 根据权利要求21所述的方法，其中所述突变体细菌集合包含0. 5X106~2X106个 突变体。25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述突变体细菌集合包含约IX10 6个突变体。26. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子诱变步骤（a)产生至少 一个转座子/50个细菌DNA碱基对的插入率。27. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子诱变步骤（a)产生至少 一个转座子/30个细菌DNA碱基对的插入率。28. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子诱变步骤（a)产生至少 一个转座子/25个细菌DNA碱基对的插入率。29. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子诱变步骤（a)产生至少 一个转座子/15个细菌DNA碱基对的插入率。30. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转座子诱变步骤（a)产生至少 一个转座子/10个细菌DNA碱基对的插入率。31. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤（a)的所述细菌DNA是染色体 (基因组）DNA。32. 根据权利要求1~30中任一项所述的方法，其中步骤（a)的所述细菌DNA是质粒 DNA或染色体（基因组）DNA和质粒DNA的混合物。33. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤（a)的所述转座子诱变在体内 发生。34. 根据权利要求1~32中任一项所述的方法，其中步骤（a)的所述转座子诱变在体 外发生。35. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细菌是革兰氏阳性或革兰氏阴 性细菌，例如沼泽红假单抱菌（Rhodopseudomonaspalustris) 〇36. 根据权利要求1~35中任一项所述的方法，其中所述细菌是益生菌。37. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过由步骤（b)的突变体集合以 IO7~10 9,例如约108,cfu接种生长培养基，由所述突变体集合生长细菌。38. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过对邻近或接近TnA插入位点的 DNA测序比较测试培养物之间TnA插入的分布。39. 根据权利要求38所述的方法，其中邻近或接近所述TnA插入位点的DNA的所述测 序包含转座子-细菌DNA接合物的选择性扩增。40. 根据权利要求38或39所述的方法，其中所述测序包含边合成边测序（SBS)生物化 学。41. 根据权利要求38~40中任一项所述的方法，其中对邻近或接近所述Tn4插入位点 的DNA的约25、50、75、100或多于100个DNA碱基对进行测序。42. 根据权利要求38~41中任一项所述的方法，其中所述测序的DNA是5'和/或3' 至所述TnA插入位点。43. -种通过由根据前述权利要求中任一项中所定义的方法可获得的、或获得的突变 体细菌。
【专利摘要】描述了在选择的生长条件下表现出改善的存活和/或生长的突变体细菌的生产方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过采用活化转座子(TnA)的转座子诱变生产突变体细菌集合，其中所述TnA包含能够增加其插入位点处或附近基因转录的启动子；(b)在所述选择的生长条件下和在一种或多种参照条件下由所述突变体集合生长细菌从而产生两种以上测试培养物；和(c)比较测试培养物之间的TnA插入的分布以识别出在所述选择的生长条件下不利于生长和/或存活的第一类基因和在所述选择的生长条件下有利于生长和/或存活的第二类基因。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN104903446
【申请号】CN201380057726
【发明人】戴维·休·威廉斯, 阿瑟·基思·特纳, 约翰·理查德·韦恩
【申请人】贝克特沃有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2013年11月5日
【公告号】CA2890104A1, EP2917346A1, US20150307873, WO2014072697A1