小花山小橘中分离的抗虫成分的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种从植物小花山小橘中分离的抗虫成分，包括粗提物和一种新化合 物。
【背景技术】
[0002] 小花山小橘（G. parviflora (Sims)Kurz),芸香科山小橘属，为灌木或小乔木。小 花山小橘的根及叶可以作草药，其味苦，微辛，气香，性平。其中根行气消积，化痰止咳；而叶 则有散瘀消肿的功效。可用于感冒咳嗽，胃腹胀痛，消化不良，跌打瘀痛，风湿关节痛等。对 于小花山小橘，不论该植物本身，或其分离出的化学成分的生物活性的研究，都少有报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是从天然植物中提取分离出具有害虫拒食性的新物质。
[0004] 本发明发现小花山小橘的提取物具有害虫拒食性。
[0005] 本发明采用硅胶柱层析方法，从小花山小橘提取分离出一种新化合物--式I，经 鉴定，其化学结构式如下所示：
[0006]
[0007] 式 I 的化学命名是 3_amin〇-6, 8-dimethoxy-3-(2-〇xopropyl)-[l, 5] dioxocane_2, 4, 7_trione，（ 3_ 氣基 _6, 8_ 二甲氧基 _3_ (2_ 撰基丙基）_[1，5] 二氧八 环-2, 4,7_三酮）。
[0008] 将式I化合物进行赤拟谷盗成虫拒食实验证实，式I具有对害虫的拒食活性功能。
[0009] 可将式I化合物制成各种药物可接受的盐和制剂，用于制备抗虫制品。
[0010] 经试验证实，式I化合物对害虫拒食效果较为显著(见实施例)。
[0011] 本发明优点：
[0012] 式I化合物是从小花山小橘植物中提取，在自然条件下易分解，不会引起生物富 集现象，并且对人畜安全，可以作为天然农药长期使用而不会产生环境污染的问题。
【附图说明】
[0013] 图1是式I化合物的IH-NMR谱图；
[0014] 图2是式I化合物的COSY谱图；
[0015] 图3是式I化合物的HSQC谱图；
[0016] 图4是式I化合物的HMBC谱图；
[0017] 图5是式I化合物的APT谱图；
[0018] 图6是式I化合物的ESI谱图。
【具体实施方式】
[0019] 式I化合物的分离
[0020] 仪器：
[0021] Bruker ACF300和AMX500超导核磁共振仪，瑞士 Bruker公司；
[0022] 玻璃色谱柱：直径与长度 85 X 550mm，40 X 400mm、35 X 400mm、30 X 400、 25 X 400mm、20 X 350mm，购于北京博美玻璃有限公司。
[0023] 材料与试剂：
[0024] 层析硅胶（200-300目）采自青岛海洋研究所，
[0025] 薄层层析硅胶GF254购于青岛海洋化工有限公司；
[0026] 石油醚、乙酸乙酯、乙醇、丙酮等均购自北京化学试剂公司；
[0027] 95%酒精采购自北京广达恒益有限公司。
[0028] 分离方法
[0029] 1小花山小橘乙醇提取物一级硅胶柱层析分离
[0030] 首先采用薄层层析确定起始洗脱剂。将样品用丙酮稀释，用毛细管点样于GF254 薄层板上，在层析缸中加入1ml按一定比例配比的石油醚：乙酸乙酯：无水乙醇洗脱剂。将 点好样品的薄层板放入层析缸中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边〇. 3-0. 5cm，盖上缸 盖，待展开至距薄层板上沿0. 5-1. Ocm时，取出薄层板，用电吹风吹干溶剂，在紫外灯下观 察展开情况，随后将薄层板放入碘缸中显色，当最前沿斑点的Rf值在〇. 2~0. 3时，即可确 定此展开剂为起始洗脱剂。
[0031] 采用湿装法装柱，将玻璃色谱柱（85 X 550mm)垂直固定在铁架台上，在柱的下端塞 少许脱脂棉花，倒入一药匙石英砂，防止硅胶泄漏。将200~300目硅胶放入烧杯中，加入 适当量的洗脱剂，经充分搅拌，将硅胶内的气泡除去后再加入柱内，一边沉降一边添加。硅 胶加完后，仍使洗脱剂流滴一段时间，然后使色谱柱中高于硅胶面上的洗脱剂几乎全部流 入接受瓶内。然后用橡皮塞在色谱柱外敲打，将硅胶柱内的气泡赶净。色谱柱装好后，使其 静置过夜，以压实硅胶，提高分离效果。
[0032] 样品的加入，采用干法加样。待硅胶柱静置过夜后，先将色谱柱中硅胶面上的多余 洗脱剂放出，丙酮溶解样品加入适当量的200-300目硅胶拌匀，搅拌或者在用吹风机吹干 溶剂成粉末状，用小勺将拌匀后的样品缓慢加入色谱柱中。样品加入后，用滴管吸取少量洗 脱剂缓缓冲洗色谱柱壁，打开活塞将洗脱剂慢慢放出，待柱面上没有洗脱剂时，将一块脱脂 棉平铺于柱面，压上玻璃棒，防止加入洗脱剂时破坏色谱柱面，加入洗脱剂后，开始分离。
[0033] 洗脱剂采用石油醚-乙酸乙酯-乙醇，按极性从小到大梯度洗脱，采用等馏分收集 法（500mL)收集，使用旋转蒸发仪回收溶剂，在回收过程中将馏分经薄层层析（TLC)检验后 将成分相同或相似者合并。洗脱时先加起始洗脱剂，每个洗脱剂梯度一般收集5-6个500mL 馏分，按从小到大增加洗脱剂(石油醚：乙酸乙酯：无水乙醇）极性。加到50%无水乙醇后， 当收集5-6个收集瓶后，洗脱剂不再倒回色谱柱内，待到柱内表面没有溶剂时，加入无水乙 醇洗脱，收集5-6个收集瓶时，洗脱剂不再倒回色谱柱内，待到柱内表面没有溶剂时，加入 水洗脱，洗脱下来的溶液用三氯甲烷萃取，萃取液经旋转蒸发仪回收试剂。小花山小橘乙醇 提取物经一级柱层析分离，并通过薄层层析检测合并后相同的组分，然后继续进行二级硅 胶柱层析分离。
[0034] 2小花山小橘乙醇提取物二级硅胶柱层析分离
[0035] 采用薄层层析检验，确定各部分起始洗脱剂。方法同3. 2. 1。
[0036] 采用湿法装柱，玻璃色谱柱规格为35 X 400mm，30
[0037] X 400mm，40 X 400mm，其余同 3. 2. 1 方法。
[0038] 样品的加入，采用干法加样。方法同3. 2. 1。
[0039] 二级柱层析分离采用等梯度洗脱，按等馏分收集法（150mL)收集，使用旋转蒸发仪 回收溶剂，经薄层层析（TLC)检验后将成分相同或相似者合并。当活性成分成功洗脱后，洗 脱液不再倒回色谱柱内，待到柱内表面没有溶剂时，加入无水乙醇洗脱，收集4-5个收集瓶 后，洗脱液不再倒回色谱柱内，直到没有洗脱液可收集。
[0040] 3NMR 和 MS 分析
[0041] 将样品用氘代氯仿（CDC13)溶解，加入核磁管