列。
[0076] 本发明中，两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分重组酶的序 列。也就是说，编码重组酶的序列在两种或更多种核酸中的至少两种之间分开。因此，该方 法可被称为分开重组酶法（split-recombinase approach)。可以在体内实施位点特异性重 组位点之间的核酸序列的外重组。
[0077] 本发明所述的方法中，体内重组可以在任何合适的宿主细胞中进行，例如在原核 细胞或真核细胞中进行。
[0078] 在本发明的方法中，在体内实施核酸的相互重组以及与靶位点的重组。
[0079] 本发明所述的方法中，提供两种或更多种核酸。所述的两种或更多种核酸总共提 供：(a)能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列；(b)两个或更多个位点特异性重组位 点；和（C)编码识别位点特异性重组位点的重组酶的序列。
[0080] 这并不意味着两种或更多种核酸中的每一种都包含（a)、（b)和（c)中所描述的 序列。而是，两种或更多种核酸被总合在一起成为组时，这些核酸必须包含（a)、(b)和（c) 中所描述的序列。因此，一种核酸可包含（a)、(b)和（c)中所描述的一种或更多种序列，第 二种核酸可包含（a)、（b)和（c)中所描述的另一些序列。典型地，两种或更多种核酸中的 每一种都将包含（a)、(b)和（c)中所描述的至少一种序列。然而，也可以提供不包含（a)、 (b)或（c)中所描述的至少一种序列的额外核酸。
[0081] 图1展示了所述方法的一种方式，其中使用4种核酸，但技术人员将很容易想到更 多的方式。所述方法中使用的核酸的数目可以是2、3、4、5、6或更多。
[0082] 典型地，编码重组酶的序列在两种核酸序列之间分开（这两种核酸序列中的每一 种都编码无功能的部分重组酶，但当二者被重组时将编码有功能重组酶）。然而，编码重组 酶的序列可被分开为3种、4种或更多种核酸序列。
[0083] 当编码重组酶的序列在两种核酸序列之间分开时，典型地这两种序列中的每一种 都还可以包含位点特异性重组位点。图1中展示了这种方法。或者，位点特异性重组位点 可由能够与包含编码重组酶的序列的核酸序列重组的额外核酸序列提供。
[0084] 在本发明所述的方法中，两种或更多种核酸能够相互同源重组以产生单一核酸。 由于能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列的存在，核酸在靶位点作为单一连续序列整 合。此外，两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分重组酶的序列。
[0085] 因此，在本发明的方法中，两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点的侧翼序列 重组。以这种方式，编码有功能重组酶的连续核酸序列可与至少两个位点特异性重组位点 一起被插入至靶位点。这种有功能的编码编码的的序列典型地被插入在靶位点以使其侧翼 是至少两个位点特异性重组位点。当重组酶表达时，位于位点特异性重组位点之间的序列 可被外重组（out-recombined)。如果重组酶序列位于位点特异性重组位点之间，那么它将 被外重组。然而，如果重组酶序列位于位点特异性重组位点之外，那么其将被保留在靶位 点。
[0086] 当重组发生后，位点特异性重组位点和重组酶序列的侧翼将会是能够与靶位点的 侧翼序列同源重组的序列。
[0087] 可实施本发明所述的方法以同时靶向多于1个（例如2、3、4、5或更多个）靶位点。 在这种方法中，所述两种或更多种核酸总共包含能够与两个或更多个靶位点的侧翼序列同 源重组的序列。以这种方式，所述两种或更多种核酸相互重组并与靶位点的侧翼序列重组， 从而导致每个靶位点处插入至少两个位点特异性重组位点。所提供的两个位点特异核酸使 得编码有功能重组酶的连续核酸序列被插入在至少一个靶位点，任选地位于至少两个位点 特异性重组位点之间。其它靶位点不必须地包含编码有功能重组酶的序列，但每个靶位点 将包含至少两个位点特异性重组位点（可被重组酶靶向）。也可实施本发明所述的方法以 在所有或一些靶位点插入编码重组酶的序列。
[0088] 再次，在每个靶位点，所述位点特异性重组位点以及任何编码重组酶的序列的侧 翼都将是能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列。
[0089] 本发明的方法中，所述两种或更多种核酸能够相互重组以产生单一核酸。由于能 够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列的存在，核酸在靶位点作为单一连续序列被整合。
[0090] 更详细地，本发明所提供的两种或更多种核酸总共包含能够同源重组针对靶位点 的两个或更多个同源重组位点的序列。典型地当所述方法靶向单一的靶位点时，所述两种 或更多种核酸将提供两种这样的序列。这些序列被提供以使包含至少两种或更多种核酸的 连续核酸序列（当被相互重组时）通过与靶序列侧翼的基本同源的序列重组而被插入在靶 位点。
[0091] 为了通过双交换事件实现同源重组，需要这些侧翼序列存在于通过所述两种或更 多种核酸的重组得到的连续序列的两侧/端且需要与靶位点两侧的序列基本同源，这对技 术人员而言是显而易见的。因此，能够同源重组的序列典型地被提供以使它们位于通过所 述两种或更多种核酸的重组得到的核酸序列的"5' "和"3' "末端。
[0092] 此外，根据本发明所提供的至少两种核酸能够相互重组。因此，核酸的末端被方便 地设计以使相互重组能够发生且核酸将以期望的方向和顺序被组装。因此，所提供的核酸 的末端序列将与想要与之重组的核酸的末端序列基本同源。
[0093] 本发明所使用的术语"基本同源"的意思是：第一核酸序列与想要与之重组的第 二核酸序列在不多于约3kb，优选地不多于约2kb，更优选地不多于约lkb，甚至更优选地 不多于约〇. 5kb，甚至更优选地不多于约0. 2kb，甚至更优选地不多于约0. lkb，如不多于约 0. 05kb，例如不多于约0. 03kb的区域中的同一性程度为至少约70%，至少约80%，优选地 至少约90%。因此，所需的同一性程度可取决于基本同源序列的长度。同源序列越短，同源 性百分比可越高。
[0094] 在本发明中，所述两种或更多种核酸总共包含两个或更多个位点特异性重组位 点。这些位点特异性重组位点被由两种或更多种核酸总共编码的重组酶识别。关键的是， 提供所述两种或更多种核酸以使至少两种核酸各包含编码无功能的部分重组酶编码序列。 当重组两种或更多种核酸时，这产生编码有功能重组酶的连续序列。
[0095] 所述位点特异性重组位点和重组酶被选择以使重组酶可以靶向位点特异性重组 位点，导致位于重组位点之间的序列被外重组（out-recombination)。
[0096] 术语"重组酶"或"位点特异性重组酶"或其类似物指的是识别和结合至短核酸位 点或"位点特异性重组位点"（即重组酶识别位点）并催化与这些位点相关的核酸重组的酶 或重组酶。这些酶包括重组酶、转座酶和整合酶。
[0097] "位点特异性重组位点"或其类似物指的是短核酸位点或序列（即重组酶识别 位点），其被序列或位点特异性重组酶识别并在位点特异性重组事件过程中变成交换 (crossover)区域。序列特异性重组酶祀位点的实例包括但不限于Iox位点、att位点、dif 位点和frt位点。
[0098] 本文中使用的术语"lox位点"指的是一种核苷酸序列，其中噬菌体Pl的ere基因 的产物（Cre重组酶）能够在该序列上催化位点特异性重组事件。本领域已知多种Iox位 点，包括天然存在的1〇xP、1〇xB、IoxL和IoxR以及大量突变的或变体Iox位点，例如1〇Χ66、 1οχ71、1οχΡ511、1οχΡ514、1οχΔ86、ΙοχΔ 117、loxC2、1οχΡ2、1οχΡ3 和 Iox P23〇
[0099] 本文中使用的术语"frt位点"指的是一种核苷酸序列，其中酵母2微米质粒的FLP 基因的产物（FLP重组酶）能够在该序列上催化位点特异性重组。
[0100] 位点特异性重组位点可使重组酶表达后的外重组在靶位点产生不被重组酶识别 的单个突变位点特异性重组位点。特别地，所述Iox位点可以是l〇x66和lox71 (Albert， Η. , Dale, Ε. C. , Lee, Ε. , &0w, D. W. (1995)). Site-specific integration of DNA into wild-type and mutant Iox sites placed in the plant genome. Plant Journal，7(4)， 649-659)〇
[0101] 除了重组酶、位点特异性重组位点和能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列之 外，可以进行这样的方法：其中两种或更多种核酸总共包含编码标记的序列，以使两种或更 多种核酸的重组导致所述标记编码基因序列被插入在靶位点。这种编码标记的序列可位于 至少两种能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列之间。
[0102] 典型地，可实施所述方法以使编码标记的序列位于两个或更多个位点特异性重组 位点之间。以这种方式，标记基因可通过重组酶的表达被外重组。
[0103] 以这种方式，可以使用相同的标记以重复模式实施所述方法多于一个重组循环。 可进一步将这种方法与突变位点特异性重组位点的使用相结合，其中一旦标记被外重组， 所述位点就不能被重组酶靶向。
[0104] 在本发明的方法中，两种或更多种核酸总共可包含两种或更多种不同的标记编码 序列以使所述两种或更多种核酸的重组导致不同的标记基因编码序列被插入在各靶位点。 可提供能够与两个或更多个靶位点的侧翼序列同源重组的序列以实施这种方法。进一步， 可以使用一种标记靶向至少两个靶位点并使用不同的标记靶向一个或更多个其它靶位点。
[0105] 在本发明所述的方法中，靶位点可包含被破坏和/或部分或全部缺失的编码序 列。典型地，所述方法在靶位点增加新序列；这种新序列典型地将置换靶位点的序列。
[0106] 如上所述，当在宿主细胞体内实施重组时，置换序列可以例如赋予可选择的表型。 在这种情况下，所述置换序列包含选择标记。优选地，实施这种方法以使标记可通过重组酶 的表达被外重组。
[0107] 置换序列还可以是靶序列的经修饰形式，例如以改变对感兴趣的序列的调控或表 达与原始基因产物相比性质改变的经修饰的基因产物。
[0108] 置换序列还可以组成已存在于宿主细胞基因组中的感兴趣的序列的额外拷贝，以 扩增所述感兴趣的序列。
[0109] 置换序列可以相对于宿主细胞是同源的或异源的序列。其可以从任何合适的来源 获得或者可通过订制合成制备。
[0110] 靶序列可以是任何感兴趣的序列。例如，靶序列可以是利用失活或修饰该序列而 被研宄其功能的序列。靶序列还可以是这样的序列，其失活、修饰或过表达是期望的以赋予 宿主细胞期望的表型。典型地，本发明所述的方法将导致靶位点的一些核酸序列被移除。然 而，本发明所述的方法可被用于在靶位点插入序列而不从靶位点丢失任何序列。
[0111] 在本公开的上下文中，术语"核酸"、"核酸序列"、"多核苷酸"、"多核苷酸序列"、"核 酸片断"、"分离的核酸片段"在本文中可被交换使用。
[0112] 这些术语包括核苷酸序列及其类似物。核酸可以是可为单链或双链的DNA或RNA 的聚合物，任选地，其含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。
[0113] DNA聚合物形式的核酸可包括cDNA、基因组DNA、合成DNA的一种或更多种区段，或 其混合物中。
[0114] 术语"分离的核酸"和其类似物指的是大体上不含其它核酸序列（例如但不限于 其它染色体的和染色体外的DNA和/或RNA)的核酸。可从分离的核酸天然存在的宿主细 胞中将其纯化。
[0115] 可使用技术人员已知的常规核酸纯化方法获得分离的核酸。该术语还包括重组 的核酸和化学合成的核酸。典型地，可利用本领域已知的任何扩增方法（例如PCR、RT-PCR 等）产生适用于本发明的两种或更多种核酸中的每一种。本文中使用的术语"扩增"或"扩 增反应"指的是用于增加核酸中靶序列拷贝的任何体外方法。有时候，扩增指的是靶核酸的 "指数"增加。然而，本文中使用的"扩增"还可以指选择的核酸靶序列的数目线性增加，但 典型地不同于一次、单引物延伸步骤。
[0116] 典型地，两种或更多种核酸被引入宿主细胞以使重组事件可发生。可使用本领域 技术人员公知的多种技术将所述的两种或更多种核酸引入宿主细胞。被用于引入异源的核 酸至多种生物体的方法的非限制性实例包括：转化、转染、转导、电穿孔、超声介导的转化、 粒子轰击等。在某些情况下，加入载体分子能够增加典型地被认为很难通过常规方法转化 的细胞对DNA的摄取。技术人员易于得知转化的常规方法。
[0117] 用于产生两种或更多种核酸以及之后将它们引入宿主细胞的程序是本领域技 术人员公知的。（参见，例如 Sambrook&Russell，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第三版，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY，2001;和 Ausubel et al·，Current Protocols in Molecular Biology, Wiley InterScience，NY，1995)〇
[0118] 此外，标准的分子生物学技术（例如DNA分离、凝胶电泳、核酸的酶促限制性修饰、 Southern分析、细胞的转化等）是技术人员已知的且被例如Sambrook等（1989) "Molecular Cloning ：a laboratory manual"，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，New York 和 Innis 等（1990) " PCR protocols，a guide to methods and applications" Academic Press，San Diego 描述。
[0119] 可以按照标准的PCR扩增技术，使用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板和恰当 的寡核苷酸引物扩增适用于本发明所述的方法的核酸。由此扩增的核酸可被克隆至恰当的 载体（如果期望）和/或通过核酸序列分析被表征。
[0120] 可实施本发明所述的方法以使两种或更多种核酸被重组为单一核酸，之后其与靶 位点重组。
[0121] 可实施本发明所述的方法，其中所述两种或更多种核酸的相互重组以及与靶位点 的重组同时发生。
[0122] 在本发明所述的方法中，至少两种核酸中的两种可各包含