一种红平红球菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及环境微生物技术领域，具体涉及一种红平红球菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着海上石油开发和油轮事故的频发，海上石油污染日益严重，直接影响了海洋 养殖和捕捞业的发展。溢油事故发生后，经物理方法（如机械回收等）可清除部分表面溢 油，剩余的溢油在风、浪、流的作用下，会漂移至滩涂。石油中难降解的芳烃组分（致癌物 质）长期滞留在滩涂土壤环境中，对滩涂生态系统及人体健康造成巨大的持久性损害。微 生物治理技术是国际上公认的高效修复石油污染的新技术，基于微生物能适应各种复杂的 生态环境（如海洋滩涂），其繁殖代谢能力极强，能快速降解石油中各种有毒物质，而且具 有价格低廉、自然环保、对人畜无害等诸多优势。
[0003] 自然界中微生物降解原油的过程十分复杂，受到很多种因素的影响，例如原油的 不同成分被微生物降解的难易程度不同，还有原油风化程度、温度、环境含氧水平、营养物 质、PH和盐度等都是影响石油生物降解的重要条件。没有一种微生物有能力降解原油里的 所有成分，环境中众多微生物的共代谢作用导致了原油的降解。对环境微生物生存与代谢 机理的研究是生物修复技术的基础，是目前各国都面临的技术方法之外更深层次的问题。
[0004] 在优化现有技术方面针对生物添加法的研究有两个有价值的发展趋势：一是针对 微生物降解能力不足的生态系统，加入外源微生物做补充；二是针对土著微生物不能降解 的原油类型或重要的石油成分，选择或改造优良性能的降解微生物，其中又以后者更具技 术潜力，尤其面对一些特殊环境，如海洋滩涂高盐、海浪冲刷频繁、菌体难以附着的问题，筛 选高效耐盐烃降解菌株、微生物降解机理研究、缓释营养剂和更多疏水固定化载体的研究， 有利于海洋滩涂溢油生物修复技术的发展和工业化应用。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种红平红球菌及其应用，以解决现 有技术微生物石油烃类降解能力较低的技术问题。
[0006] 本发明解决的另一技术问题是提升微生物耐高盐环境的能力。
[0007] 本发明解决的再一技术问题是提供上述微生物在海洋石油污染中的应用。
[0008] 为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] 一种红平红球菌（Rhodococcus erythoropolis)，其保藏编号为CGMCC NO. 10975。
[0010] 上述红平红球菌用于降解石油的应用。
[0011] 优选的，所述石油是柴油。
[0012] 优选的，所述石油是正烷烃化合物。
[0013] 优选的，所述石油是芳香族化合物。
[0014] 优选的，所述降解是在15~25°C条件下进行的。
[0015] 优选的，所述降解是在pH为5~10的环境中进行的。
[0016] 优选的，所述降解是在NaCl质量浓度不超过5%的环境中进行的。
[0017] 优选的，所述应用是将红平红球菌制备成为固化吸附菌剂后利用所述固化吸附菌 剂降解石油，所述固化吸附菌剂是利用以下方法制备的：
[0018] 1)取红平红球菌，培养获得菌体浓度为IO8~10 w个/mL的菌液；
[0019] 2)取步骤1)所述菌液，向其中添加100~1000g/L沸石，充分混合，静置0. 5~ 24h，即得到所述固化吸附菌剂。
[0020] 优选的，步骤1)用于培养红平红球菌的培养基，每升该培养基包括以下成分： ΚΗ2Ρ043· 5g，Na2HPO4L 5g，MgSO4O. 7g，（_2S044g，酵母粉 0· Olg0
[0021] 本发明提供的红平红球菌，又可称之为HL-6菌株，保藏于"中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心"，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学 院微生物研究所，其保藏号为CGMCC NO. 10975,建议分类命名为红球菌（Rhodococcus erythoropolis)〇
[0022] 本发明提供的红平红球菌HL-6菌株，是从新疆油田石油污染土样中分离得到。以 柴油为唯一碳源的无机盐培养基中在25°C反复驯化培养十代而获得。
[0023] 红平红球菌HL-6的菌落特征：在LB平板上培养菌落大小直径3-5mm，菌落圆形， 较粘稠，不透明，凸起，有光泽，橙色。细胞形态特征：革兰氏染色阳性，菌体呈短杆状，不运 动，具有典型的八字型排列特征，细胞大小为〇. 8-1. 0 μ mX 2-3 μ m。
[0024] 红平红球菌HL-6的生理生化特征：生长温度10-37°C，最适15-25°C，生长pH范围 5-10, NaCl耐受性0-5%。接触酶，硝酸盐还原，脲酶，七叶灵水解，吲哚，2, 3- 丁二醇，天冬 氨酸实验均为阳性，氧化酶，M. R.，V-P，亚硝酸盐还原，反硝化，明胶液化，淀粉水解，腺嘌呤 水解实验均为阴性，能够利用甘露醇，肌醇产酸。降解烷烃和柴油，产生生物乳化剂。
[0025] 红平红球菌HL-6的16s rRNA基因序列特征：菌株接种于LB培养基，25°C摇 床培养（200rpm) 12小时，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿 法提取基因组DNA，并采用正向引物27F(5' -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和反向引物 1541R(5' -AAGGAGGTGATCCAGCC-3'），用这对引物对其16s rRNA基因进行PCR扩增，将扩增 引物送北京三博公司进行测序。PCR条件为：94°C，IOmin ;94°C，45s，55°C，45s，72°C，90s， 30个循环；72°C，10min，4°C保存。16s rRNA基因序列长度为1513bp，在GenBank中的登录 号为JQ839141，与Rhodococcus erythoropolis(GenBank accession Ν〇·ΑΥ822047)序列相 似性为99. 6%。其16s rRNA的基因序列如序列表所示。
[0026] 参照《Bergey's Manual of Determinative Bacteriology》（9th Edition, 1994) 的内容，根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16S rDNA基因序列在GenBank中的 搜索结果，经多项分类鉴定HL-6为红平红球菌。
[0027] 红平红球菌（Rhodococcus erythoropolis)HL-6可以在营养培养基，如：普通牛 肉汁、LB、营养琼脂中生长，也可以在添加葡萄糖或蔗糖的无机盐培养基中生长，也可以以 烷烃或柴油为碳源生长。菌株在10~37°C之间均可生长。
[0028] 该菌具有很高的降解石油烃的能力，可降解Cll~C36的正构烷烃和柴油。用HL-6 生长细胞进行降解实验结果表明，该菌在25°C温度条件下，通过基础培养基生长繁殖过程 能同时降解加入的lg/L的烷烃或5g/L的柴油，其基础培养基pH7. 0-7. 2。往复摇床200rpm 转速培养72h，降解率均可达70%以上，对不同碳数的烷烃降解率有较好的降解效果，如图 1，2所示。
[0029] 本发明同时提供了一种适用于海洋滩涂和海底沉积物环境石油污染的微生物修 复固化吸附菌剂制备方法，具体过程是：
[0030] 第1、选取适合降解污染区域原油的微生物菌种；
[0031] 第2、经斜面培养、摇瓶种子发酵获得菌浓为IO8~10 w个/mL的发酵菌液；
[0032] 第3、向第2步的发酵菌液中添加100-1000g/L多孔介质沸石，充分混合，静置 0. 5-24h，制得菌体吸附率多90%的固化吸附菌剂。
[0033] 本发明固化吸附菌剂在室内模拟中表现出很好的应用潜力，使用沸石作为固体吸 附材料有利于长期持菌，并降解石油烃，因此可用于滩涂和海底现场石油污染的生物修复 领域。
[0034] 本发明的优点和积极效果：
[0035] 本发明涉及的一种红平红球菌（Rhodococcus erythoropolis)HL_6可产生一种新 型的糖脂类的生物表面活性剂，对柴油、饱和烷烃和芳香族化合物都具有很好的乳化效果， 能够提高烷烃和柴油在水中的溶解度，明显促进活性菌株对烷烃