6菌株发酵液在25°C条 件下对不同链长烷烃和芳香烃的乳化能力。
[0074] Rhodococcus erythoropolis HL-6菌株在以乙醇为碳源的培养基中（同实施例 4)生长，25°C振荡培养3天，用其发酵液对柴油和不同底物进行乳化活性分析，如图4所示， 以乙醇为碳源生长，该菌发酵液能很好的乳化柴油，EI-24为100%。如图5所示，该菌在以 包括正己烷、正十四烷、正十六烷、苯、甲苯及二甲苯作为底物进行乳化性能实验，结果显示 乳化剂对低碳数烷烃和芳香烃的乳化效果比中长键烷烃效果好。对正构烷烃和芳香烃均有 良好的乳化效果。
[0075] 实施例 6 :Rhodococcus erythoropolis HL-6 对经类的乳化效果。
[0076] 考察菌株对于柴油的耐受性，当柴油浓度为5 % -30% (V/V)时，菌株HL-6均生 长良好，在30%的高柴油浓度下培养72h，选取0D600进行生物量测定，测定值为1. 25， 乳化活性达到44% (图6)。说明菌株对柴油的耐受能力较强，可以应用于较重污染的海洋 滩涂土壤的生物治理。在培养基中添加 NaCl来考察菌株的耐受性，当浓度为0-5% (W/V) 时，菌株HL-6对柴油均表现出较好的乳化活性，在2% NaCl浓度时乳化活性最高，达到 91. 82%，在5%的NaCl浓度时仍然有超过40%的乳化活性；柴油降解率也在2% NaCl浓 度时最高，达到82. 39%，在5%的NaCl浓度时仍然有超过50%的柴油降解率，说明菌株 适宜应用于海洋滩涂的高盐环境（图7)。调节培养基pH来考察菌株对酸碱的耐受性，菌 株HL-6在pH 6-9环境下均具有较好的生物量和乳化性能，随着pH的升高，生物量和乳化 活性稍有一定增高。但是在PH为5的条件下没有生物量和乳化活性，实验结果如图8所 示。说明菌株对偏碱性土壤比较适应。据相关报道，天津滨海滩涂土壤pH在7. 92-8. 24之 间，属于偏碱性的土壤。所以HL-6菌株能够很好地适应沿海滩涂土壤的酸碱度。将HL-6 菌株培养液与柴油混合，分别置于4°(：、15°(：、25°(：、37°(：、55°(：和100°(：处理2411，取出将混 合液涡旋振荡2min后再分别置于各自恒温温度，静置24h后测定不同温度下乳化液的乳 化活性。结果如图9所示，在4°(：、15°(：、25°(：、37°(：、55°(：温度下，菌株1-6培养液均显 示出良好的乳化性能，乳化活性均能达到100%;而当处理温度为l〇〇°C时，乳化活性只有 35%。因为海洋滩涂土壤温度不会超过55°C，所以说明菌株HL-6可以应用于海洋滩涂土 壤石油污染的生物修复。
[0077] 实施例7 :菌体细胞SEM检测。
[0078] 分别将LB和柴油为唯一基质培养的培养液离心取菌体，用无菌水洗掉残留的培 养基成分，进行扫描电镜观察，结果见图4,结果显示，在LB培养基中生长的菌体表面比 较干净，未发现太多的分泌物（图10A);在烃降解培养基中生长的菌体表面则分泌了很多 的粘性物质，成丝状粘附在细胞表面（图10B)，这可能是疏水性底物所诱导产生、分泌的 胞外产物，即表面活性剂类物质。电镜结果再次证明菌株HL-6可以通过分泌胞外产物来 乳化烃类物质。
[0079] 实施例8 :不同基质对菌体生长和产表面活性剂的影响。
[0080] 产表面活性剂的微生物大致可分为3类：一类是严格以烷烃作为基质的微生物， 如Corynebacterium sp.;-类是利用水溶性基质的微生物，如Bacillus sp.;另一类可 以利用烷烃和水溶性基质两者的微生物，如Pesudomonas sp.。选择亲水和疏水的不同种 基质进行实验，考察菌株HL-6在不同种基质中生长情况和产表活剂情况。结果见表1，图 11、12所示，可以看出在疏水性基质液蜡或者柴油中，培养液表面张力降低幅度明显大于 亲水性基质，由初始的62. 487mN/m降到30mN/m左右，说明菌体在疏水性基质中为了能够 更好的接触到底物会分泌表活剂降低培养液表面张力；菌体细胞粘附性也体现出了相似的 规律性，在疏水性基质中明显优于亲水性基质；生物量则在一些易于被细菌利用的亲水性 糖类基质中更高；而乳化活性则在疏水性和某些亲水性基质中都有较好的效果。说明烃降 解菌HL-6在亲水性和疏水性基质中都能产生生物表面活性剂。
[0081] 表1不同基质对菌体细胞粘附性的影响
[0082]
[0083] 实施例9 :固体微生物菌剂SEM检测。
[0084] 对空白沸石和HL-6吸附后的固体微生物菌剂样品进行了 SEM的检测，如图13所 示，可以明显看到吸附在沸石上的HL-6菌体，并且菌体密度较大，说明使用沸石作为载体 进行菌体吸附制备固体微生物菌剂是可行的。
[0085] 实施例10 :固体菌剂与液体接种降解柴油效果对比实验
[0086] 取同等菌浓的乙醇培养种子液与沸石吸附的固体微生物菌剂进行柴油降解效果 对比实验，通过无机盐培养基中培养7d，定时取样，使用M-22A红外测油仪测定柴油降解 率。实验结果见图14,可见使用液体种子液接种，在前三天降解率就达到70%以上，继续培 养降解率增长缓慢，到7d时降解率达到82. 8% ;使用固体微生物菌剂进行柴油降解实验， 可以看到在前三天降解率很低，这可能是由于固体沸石影响了菌体与培养基中柴油的接 触，但是三天之后降解率开始较快上升，培养7d后降解率可以达到74. 6%。说明固体微生 物菌剂虽然降解时间较液体接种要长，但是培养7d后降解效果也比较理想，这也证明了使 用固体微生物菌剂进行石油污染的生物修复具有较好的应用价值。
[0087] 以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种红平红球菌，其保藏编号为CGMCC NO. 10975。2. 权利要求1所述红平红球菌用于降解石油的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述石油是柴油。4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述石油是正烷烃化合物。5. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述石油是芳香族化合物。6. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述降解，是在15~25°C条件下进行的。7. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述降解，是在pH为5~10的环境中进行 的。8. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述降解，是在NaCl质量浓度不超过5 % 的环境中进行的。9. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于是将红平红球菌制备成为固化吸附菌剂后 利用所述固化吸附菌剂降解石油，所述固化吸附菌剂是利用以下方法制备的： 1) 取红平红球菌，培养获得菌体浓度为IO8~10 个/mL的菌液； 2) 取步骤1)所述菌液，向其中添加100~1000g/L沸石，充分混合，静置0. 5~24h， 即得到所述固化吸附菌剂。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于步骤1)用于培养红平红球菌的培养基， 每升该培养基包括以下成分=KH2PO 4 3. 5g，Na2HPO4 1.5g，MgSO4 0.7g，（MM)2SO4 4g，酵母粉 0.0 lgo
【专利摘要】本发明提供了一种高效解烃的红平红球菌HL-6及其用途。本发明红球菌是由新疆油田石油污染土壤中分离得到，生长温度10-37℃，最适15-25℃，生长pH范围5-10，氯化钠耐受性0-5％；可以烷烃或柴油为唯一碳源生长。该菌具有很高的降解石油烃的能力，可降解C11-C36的正构烷烃和柴油。对柴油具有很好的耐受度，在30％的高柴油浓度下仍然可以生长，OD600可以达到1.25，乳化活性为44％。对加入0.5％的柴油，72h后降解率达到78.5％。菌株在亲水性和疏水性基质中均能产生生物表面活性剂，并且对饱和烷烃和芳香族化合物都具有很好的乳化效果。
【IPC分类】C12N1/20, C12N11/14, B09C1/10
【公开号】CN105018390
【申请号】CN201510475359
【发明人】黄磊, 李申
【申请人】天津翌石开元科技发展有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月5日