一种细胞寒证模型的建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞药理实验技术领域，特别涉及一种细胞寒证模型的建立方法。
【背景技术】
[0002] 四性是指药物有寒热温凉四种不同的药性，又称四气。它是中药药性理论的重要 组成部分，也是中药区别于植物药、天然药的重要标志。因此，用现代科学知识探讨和阐明 药性的本质及药性的发生机制是极为必要的。从上个世纪中叶以来，国内外学者从临床研 究、实验研究、文献研究及中药物质基础研究等方面进行了广泛而深入的研究，主要集中在 中药四性及其所针对的寒热病症在药物、机体间能量代谢关系、药物整体功效特征、药物对 神经系统功能影响、药物基础物质成分、药物对机体内分泌系统功能影响、药物主要活性成 分分子量等方面。实践证明，对中药寒热药性属性的规律性认识主要来自于药物作用于人 体所产生的反应和所获得的疗效的总结。决定一种中药是寒性还是热性不仅在于哪一种或 哪几种物质成分种类、数量的多少，还决定于中药固有物质在体内对相应寒证和热证能不 能起到调节作用、起到什么程度的调节作用。以往有关能量代谢的研究主要集中在动物体 内实验来。涉及到寒热药性中药对体温、耗氧量、超氧化物歧化酶、琥珀酸脱氢酶等基础指 标，以及从摄入能、消化能、可代谢能等方面探讨寒热药性的影响。为了在细胞水平进行药 性的寒热研究，我们运用寒性药大黄含药血清建立细胞寒证模型，拟从细胞水平探索符合 中药四性研究的方法与手段，阐示寒热药性的本质及性效发生规律，为更好的指导临床用 药奠定基础。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是建立寒证细胞模型，为从细胞水平进行不同寒热药性对能量代谢 的影响提供可靠模型，并可进一步拓展应用于药性其他方面的研究。本发明是体外培养肝 原代细胞，加入大黄含药血清，通过检测对细胞Na+- K+-ATP酶、Ca2+_ Mg2+-ATP酶、T-ATP 酶活力，ATP含量及能荷，线粒体膜电位，细胞内游离钙离子浓度等各指标，分析大黄含药血 清组与正常胎牛血清培养组在肝细胞能量代谢方面的不同影响，从而建立细胞寒证模型。 具体细胞寒证模型的建立方法如下： 一种细胞寒证模型的建立方法： 一、培养原代肝细胞：用75%的酒精擦拭乳鼠，带入超净工作台，冰盘下断头取肝脏，手 术刀削除包膜和结缔组织等。PBS清洗两三次，剪切肝脏成lmm3大小的组织块，再用PBS吹 打清洗两三次，待组织块沉淀后弃上清液。吸取〇. 20%的胶原酶2ml，放入4°C冰箱静置消 化过夜。吸取2ml完全培养液用以终止胶原酶消化，将消化完全的组织块用吸管吹打，吹打 过程中力度均匀，尽量不要出现气泡以及尽量避免组织粘附在吸管壁上。吹打后的悬液用 200目尼龙网过滤到小烧杯，得到的滤液再次用吸管吹打，吹打后的悬液加入少量完全培养 液，4°C冰箱静置20min，在静置过程中血细胞以及细胞碎片大多都悬浮于悬液中，而肝细胞 则会沉淀于底部，弃悬液。加入完全培养液lml，吹打起沉淀的细胞，1000r/min离心5min, 弃上清液。重复操作离心三次，纯化肝细胞。最后一次离心后加入完全培养液吹细胞，将 吹打均匀的细胞悬液等量的转移到培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。10小时后首次 换液，换液时应该缓慢的吸取出上次的培养液，然后贴培养瓶底部添加入新的培养液4ml。 以后每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化，并且拍照，每隔两天换一次培养液，换液量为 4ml〇
[0004] 二、检测ATP酶活力：原代培养的肝细胞在6-10小时之内对培养的细胞进行第一 次换液，换液标准为：全量换液，换液量为每孔50〇μ1 ;经过24小时培养后第二次换液时进 行药物干预细胞培养。所用培养液分别为20%大黄含药血清培养液，20%空白血清培养液， 换液量为50〇μ1，并且做三组平行实验培养24小时后，用PBS缓冲液冲洗2-3次去除含有含 药血清的培养液。此时所得的细胞即为ATP酶活力检测的实验细胞。将培养板上的贴壁肝 细胞用细胞刮沿壁轻轻地刮下来，收集好每个培养孔里的悬液，然后在倒置显微镜下采用 血球计数板和细胞计数器进行细胞计数。将收集好各组细胞储备于塑料离心管里，然后置 于超声波细胞粉碎机进行超声波细胞破碎。破碎后的细胞即可用于试剂盒检测。大黄含药 血清组与空白血清组相比，原代肝细胞Na + - K + - ATP酶活力显著降低，差异具有显著 性，且具有统计学意义（P〈〇. 05)。大黄含药血清组与空白血清组相比，原代肝细胞Ca2 + -Mg2 + _ ATP酶活力显著降低，差异具有显著性，且具有统计学意义（P〈0. 05)。大黄含药血 清组与空白血清组相比，原代肝细胞T-ATP酶活力显著降低，差异具有显著性，且具有统计 学意义（P〈〇. 05)。
[0005] 三、测定ATP含量及其能荷：将大黄含药血清干预培养后的原代肝细胞用细胞刮 从培养板中收集后细胞计数不少于IX 1〇6, l〇〇〇r/min离心5min，制成混悬液，然后分别加 入蛋白沉淀剂沉淀蛋白，再次4000r/min离心20 min,吸取上清液，4 °C储存备用，进样前 用0. 45Mm微孔滤膜过滤。精密称取对照品ATP、ADP、AMP适量，加甲醇分别溶解至浓度为 0.05mg/ml、0.03mg/ml、0.06mg/ml，4 °C储存备用。色谱条件为：流动相：乙腈（A)_50mmol/ L磷酸钠(磷酸调PH=7)、10mmol/L四丁基溴化铵（B)，其中VA:VB=5:95 ;流速：LOml/min ; 检测波长：254nm ;柱温：30 °C ;ATP及能荷计算方法为：ATP含量（μ g/g)=样品峰面积X 对照品的浓度/ (对照品峰面积X样品浓度）；ADP含量（μ g/g)=样品峰面积X对照品 的浓度/ (对照品峰面积X样品浓度）;AMP含量（μ g/g)=样品峰面积X对照品的浓度/ (对照品峰面积X样品浓度）；能荷=(ATP+0. 5XADPV(ATP+ADP+AMP)。且大黄含药血清组 与空白血清组相比，原代肝细胞的ATP含量显著降低，差异具有显著性（P〈0. 05)。原代肝细 胞的能荷显著降低，差异具有显著性（P〈〇. 05)。
[0006] 四、检测游离钙浓度：原代细胞培养，将消化后的肝细胞悬液均匀的分配到六孔 板中，置于二氧化碳培养箱中培养；在6-10小时之内对培养的细胞进行第一次换液，换液 标准为：全量换液，换液量为每孔50〇μ1 ;经过24小时培养后第二次换液时进行药物干预 细胞培养。所用培养液为20%大黄含药血清培养液，20%空白含药血清培养液，换液量为 50〇μ1，并且做三组平行实验；培养24小时后，用PBS缓冲液冲洗2-3次去除含有含药血清 的培养液；然后每孔中滴加20〇μ1 Fluo-3/AM工作液进行细胞染色；将培养板置于37°C的 二氧化碳培养箱中避光孵育30分钟； 去除Fluo-3/AM工作液，用PBS冲洗2次，加入20〇μ1培养液，将培养板用锡纸包裹避 光，室温放置30min。用激光共聚焦显微镜分别在10倍、20倍视野里观察染色细胞的形态， 并且做好实验数据的记录。大黄含药血清组与空白血清组相比，原代肝内游离钙浓度显著 降低，差异具有显著性，且具有统计学意义（P〈〇. 05)。
[0007] 五、检测细胞膜电位：原代细胞培养，将消化后的肝细胞悬液均匀的分配到六孔 板中，置于二氧化碳培养箱中培养；在6-10小时之内对培养的细胞进行第一次换液，换液 标准为：全量换液，换液量为每孔50〇μ1 ;经过24小时培养后第二次换液时进行药物干预 细胞培养。所用培养液为20%大黄含药血清培养液，20%空白含药血清培养液，换液量为 50〇μ1，并且做三组平行实验；培养24小时后，用PBS