缓冲液冲洗2-3次去除含有含药血清 的培养液；然后每孔中滴加20(^lFlu〇-3/AM工作液进行细胞染色；将培养板置于37°C的二 氧化碳培养箱中避光孵育30分钟；去除Fluo-3/AM工作液，用PBS冲洗2次，加入20〇μ1培 养液，将培养板用锡纸包裹避光，室温放置30min。用激光共聚焦显微镜分别在10倍、20倍 视野里观察染色细胞的形态，并且做好实验数据的记录。大黄含药血清组与空白血清组相 t匕，原代肝细胞膜电位显著降低，差异具有显著性，且具有统计学意义（P〈〇. 05 )。
[0008] 本发明的优点是：细胞寒证模型的建立，可以为体外进行寒热药性对能量代谢的 影响搭建了细胞平台。为研究寒热药性对能量代谢的影响提供了良好的细胞模型，以利于 体外高通量进行寒热药的能量代谢研究。
【附图说明】
[0009] 图1是细胞内钙离子表达观察图（Fluo-3染色，激光共聚焦显微镜下观察）； 图2是罗丹明123染色肝细胞膜电位观察图（罗丹明123染色，激光共聚焦显微镜下观 察)。
【具体实施方式】
[0010] 一种细胞寒证模型的建立方法： 一、原代肝细胞培养：用75%的酒精擦拭乳鼠，带入超净工作台，冰盘下断头取肝脏，手 术刀削除包膜和结缔组织等。PBS (用量：l-2ml)清洗两三次，剪切肝脏成lmm3大小的组 织块，再用PBS吹打清洗两三次，待组织块沉淀后弃上清液。吸取0. 20%的胶原酶2ml (以 浸过组织块为适宜)，放入4°C冰箱静置消化过夜。吸取2ml完全培养液用以终止胶原酶消 化，将消化完全的组织块用吸管吹打，吹打过程中力度均匀，尽量不要出现气泡以及尽量避 免组织粘附在吸管壁上。吹打后的悬液用200目尼龙网过滤到小烧杯，得到的滤液再次用 吸管吹打，吹打后的悬液加入少量完全培养液，4°C冰箱静置20min，在静置过程中血细胞以 及细胞碎片大多都悬浮于悬液中，而肝细胞则会沉淀于底部，弃悬液。加入完全培养液lml， 吹打起沉淀的细胞，l〇〇〇r/min离心5min，弃上清液。重复操作离心三次，纯化肝细胞。最 后一次离心后加入完全培养液吹细胞，将吹打均匀的细胞悬液等量的转移到培养瓶中，置 于二氧化碳培养箱中培养。10小时后首次换液，换液时应该缓慢的吸取出上次的培养液，然 后贴培养瓶底部添加入新的培养液4ml。以后每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化，并且 拍照，每隔两天换一次培养液，换液量为4ml。
[0011] 二、检测ATP酶活力：原代培养的肝细胞在6-10小时之内对培养的细胞进行第一 次换液，换液标准为：全量换液，换液量为每孔50〇μ1 ;经过24小时培养后第二次换液时进 行药物干预细胞培养。所用培养液分别为20%大黄含药血清培养液，20%空白血清培养液， 换液量为50〇μ1，并且做三组平行实验培养24小时后，用PBS缓冲液冲洗2-3次去除含有含 药血清的培养液。此时所得的细胞即为ATP酶活力检测的实验细胞。将培养板上的贴壁肝 细胞用细胞刮沿壁轻轻地刮下来，收集好每个培养孔里的悬液，然后在倒置显微镜下采用 血球计数板和细胞计数器进行细胞计数。将收集好各组细胞储备于塑料离心管里，然后置 于超声波细胞粉碎机进行超声波细胞破碎。破碎后的细胞即可用于试剂盒检测。大黄含药 血清组与空白血清组相比，原代肝细胞Na + - K + - ATP酶活力显著降低，差异具有显著 性，且具有统计学意义（P〈〇. 05)。（详见表1) 表1大黄含药血清对原代肝细胞Na + -K + -ATP酶活力的影响
大黄含药血清组与空白血清组相比，原代肝细胞Ca2 + - Mg2 + - ATP酶活力显 著降低，差异具有显著性，且具有统计学意义（P〈〇. 05)。（详见表2) 表2大黄含药血清对原代肝细胞Ca2+_ Mg2+_ ATP酶活力的影响
大黄含药血清组与空白血清组相比，原代肝细胞T-ATP酶活力显著降低，差异具 有显著性，且具有统计学意义（P〈〇. 05)。（详见表3) 表3大黄含药血清、附子含药血清对原代肝细胞T-ATP酶活力的影响
三、 测定ATP含量及其能荷：将大黄含药血清干预培养后的原代肝细胞用细胞刮从培 养板中收集后细胞计数不少于IX 1〇6, l〇〇〇r/min离心5min，制成混悬液，然后分别加入 蛋白沉淀剂沉淀蛋白，再次4000r/min离心20 min,吸取上清液，4 °C储存备用，进样前 用0. 45Mm微孔滤膜过滤。精密称取对照品ATP、ADP、AMP适量，加甲醇分别溶解至浓度为 0.05mg/ml、0.03mg/ml、0.06mg/ml，4 °C储存备用。色谱条件为：流动相：乙腈（A)_50mmol/ L磷酸钠(磷酸调PH=7)、10mmol/L四丁基溴化铵（B)，其中VA:VB=5:95 ;流速：LOml/min ; 检测波长：254nm ;柱温：30 °C ;ATP及能荷计算方法为：ATP含量（μ g/g)=样品峰面积X 对照品的浓度/ (对照品峰面积X样品浓度）；ADP含量（μ g/g)=样品峰面积X对照品 的浓度/ (对照品峰面积X样品浓度）;AMP含量（μ g/g)=样品峰面积X对照品的浓度/ (对照品峰面积X样品浓度）；能荷=(ATP+0. 5XADPV(ATP+ADP+AMP)。且大黄含药血清组 与空白血清组相比，原代肝细胞的ATP含量显著降低，差异具有显著性（P〈0. 05)。原代肝细 胞的能荷显著降低，差异具有显著性（P〈〇. 05)。（详见表4) 表4大黄含药血清对于原代肝细胞ATP含量和能荷的影响
四、 检测游离钙浓度：原代细胞培养，将消化后的肝细胞悬液均匀的分配到六孔板中， 置于二氧化碳培养箱中培养；在6-10小时之内对培养的细胞进行第一次换液，换液标准 为：全量换液，换液量为每孔50〇μ1 ;经过24小时培养后第二次换液时进行药物干预细胞 培养。所用培养液为20%大黄含药血清培养液，20%空白含药血清培养液，换液量为50〇μ1， 并且做三组平行实验；培养24小时后，用PBS缓冲液冲洗2-3次去除含有含药血清的培养 液；然后每孔中滴加20〇μ1 Fluo-3/AM工作液进行细胞染色；将培养板置于37°C的二氧化 碳培养箱中避光孵育30分钟； 去除Fluo-3/AM工作液，用PBS冲洗2次，加入20〇μ1培养液，将培养板用锡纸包裹避 光，室温放置30min。用激光共聚焦显微镜分别在10倍、20倍视野里观察染色细胞的形态， 并且做好实验数据的记录。大黄含药血清组与空白血清组相比，原代肝内游离钙浓度显著 降低，差异具有显著性，且具有统计学意义（P〈〇. 05 )。（详见表5 ) 表5附子含药血清对原代肝细胞内游离钙浓度的影响
五、检测细胞膜电位：原代细胞培养，将消化后的肝细胞悬液均匀的分配到六孔板中， 置于二氧化碳培养箱中培养；在6-10小时之内对培养的细胞进行第一次换液，换液标准 为：全量换液，换液量为每孔50〇μ1 ;经过24小时培养后第二次换液时进行药物干预细胞 培养。所用培养液为20%大黄含药血清培养液，20%空白含药血清培养液，换液量为50〇μ1， 并且做三组平行实验；培养24小时后，用PBS缓冲液冲洗2-3次去除含有含药血清的培养 液；然后每孔中滴加20(^lFlu〇-3/AM工作液进行细胞染色；将培养板置于37°C的二氧化碳 培养箱中避光孵育30分钟；去除Fluo-3/AM工作液，用PBS冲洗2次，加入20〇μ1培养液， 将培养板用锡纸包裹避光，室温放置30min。用激光共聚焦显微镜分别在10倍、20倍视野 里观察染色细胞的形态，并且做好实验数据的记录。大黄含药血清组与空白血清组相比，原 代肝细胞膜电位显著降低，差异具有显著性，且具有统计学意义（