一种mc3t3-e1成骨细胞氧化应激测试方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种氧化应激测试方法，特别涉及一种成骨细胞氧化应激测试方法。
【背景技术】
[0002]骨质疏松症是老年常见的骨病，其特点是骨密度降低以及骨折风险明显增加，严重影响着老年人的生活质量。随着平均寿命的增加，骨质疏松症的患病率及其相关的并发症如骨折的发生率在不久的未来都将进一步的增加。老龄性骨质疏松症的诊断主要是通过骨骼的影像学检查、骨密度检测以及血液骨转换生化标志物的检测。尽管现在针对骨质疏松症的诊断和治疗策略很多，但仍无法降低骨折的发生率。因此，发展新的诊断和治疗策略是至关重要的。骨是一个基于持续的骨形成和骨吸收的稳定的动态结构。这两个过程必须是平衡的，一旦失调就会产生病理性的结构。以往，雌激素缺乏被认为不仅是女性，而且还是男性骨质疏松症发生的主要原因。更年期卵巢功能的降低导致了骨量的丢失，同时雌激素的替代可以阻止这种情况的发生，所以，成年人骨量的丢失始于性激素水平的下降。然而，大型流行病学研究已经清楚的证明，男性和女性的骨量丢失是发生在性激素改变之前，即在三十岁左右。因此，性激素缺乏并不能用来全面解释骨质疏松症的发生和发展。已有大量的证据表明随着机体的老化，体内增加的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)引起的氧化应激可以影响骨的体内平衡。发展新的治疗手段的，需要了解ROS如何参与调节骨的生物学、生理学和病理学。大量研究证据表明，ROS特别是H2O2和一些超氧化物，参与了细胞内不同的信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated ProteinKinas, MAPKs)，细胞内钙离子水平和转录因子的调控。ROS在促进氧化应激和疾病方面的有害影响近年来已引起高度关注。其中，氧化应激和骨质疏松症之间的关系是近年来研究的重点。
[0003]所以，成骨细胞进行氧化应激方法，将决定了最终氧化应激和骨质疏松症之间的研究结果，提供一种可行的成骨细胞进行氧化应激方法时非常有必要的。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种成骨细胞氧化应激测试方法，特别是针对成骨细胞MC3T3E1细胞的氧化应激测试方法，该方法将成骨细胞MC3T3-E1细胞为对象，有效测试出氧化应激刺激能引起细胞的死亡，并损害成骨细胞的正常功能，抑制成骨细胞的分化，有助于阐明氧化应激在骨质疏松症发病机制中的作用，为抗骨质疏松症新药的研制提供一定的理论依据。
[0005]衰老是生物随着时间的推移，发生的一个不可逆的过程。它是复杂的自然现象，表现为结构和机能衰退，适应性和抵抗力减退，更易感染疾病。随着年龄的增加，自由基的产生增加。在衰老及其并发症中，体内增加的活性氧(Reactive oxygen species, R0S)扮演着重要的角色。骨质疏松症是老年性疾病，患病率与年龄成正比。以往，雌激素缺乏被认为是骨质疏松症发生的主要机制。然而骨质的流失开始于三十岁，而且补充雌激素并不能有效治疗老龄性骨质疏松。衰老引起的骨质丢失是不依赖性激素的，氧化应激起了非常大的作用。
[0006]氧化应激可直接或间接地影响骨吸收与骨形成的过程。为了模仿衰老中ROS对骨代谢的影响，本发明对前成骨细胞MC3T3-E1进行H2O2刺激诱导氧化应激反应。
[0007]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0008]—种MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法，其步骤包括，
[0009](I)将a -MEM培养液37-40 °C预热20-25分钟；然后将a -MEM培养液重悬MC3T3-E1细胞，均匀，接种于培养皿中，摇匀，放入37°C、5% CO2培养箱中进行培养；
[0010](2)每2-3天换一次液，3-5天后细胞达到80-90%汇合时弃去原培养液，胎牛血清洗净后，加入Iml浓度为0.25% Trypsin-EDTA放入37°C、5% C02培养箱中1-2分钟，加入2ml培液终止消化，制成MC3T3-E1细胞悬液；
[0011 ] (3)取生长状态良好的MC3T3-E1细胞悬液接种于六孔板中，a -MEM培养液预培养24小时使细胞贴壁；
[0012](4)取步骤(3)中的浓度为0.1-1.0mmol/L的成骨细胞液，培养20-28小时后加入浓度为0.1-1.0mmol/L的过氧化氢溶液；
[0013](5)去除原有a -MEM培养液，用正常a -MEM培养液清洗2_4次后再用PBS清洗1-3次，每孔加入1ul的CCK-8毒性/增殖检测试剂，37°C避光孵育3小时；
[0014](6)在450nm波长处，测定各孔光吸收值即可。
[0015]所述a -MEM培养液中含有质量浓度为10 %的胎牛血清和质量浓度为I %的抗生素。
[0016]所述抗生素为青链霉素。
[0017]所述步骤(I)中的培养皿的厚度为10cm。
[0018]所述步骤(I)均匀的方式为十字结合八字法。
[0019]所述步骤(3)中的MC3T3-E1细胞悬液接种密度为6xl04/cm2。
[0020]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
[0021 ] 1、本发明采用成骨细胞MC3T3-E1细胞为对象，有效测试出氧化应激刺激能引起细胞的死亡，并损害成骨细胞的正常功能，抑制成骨细胞的分化，有助于阐明氧化应激在骨质疏松症发病机制中的作用，为抗骨质疏松症新药的研制提供一定的理论依据。
[0022]2、本测试方法简单、有效，便于实施。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例，对本发明作进一步说明:
[0024]主要仪器:
[0025]5 % 二氧化碳培养箱:HerA cell 150 (Heraeus, Germany) ;0.22 μ m 的微孑L 滤膜(Millipore)；酶标仪(Saf ire2, TECAN) ;pH 计(METTLER T0LED0320, Switzerland)；细胞计数板；台式水平离心机(Eppendorf，581R Germany)；电子分析天平(METTLER TOLEDO, AB204-E, Switzerland);纯水器(MilliporejUS);液氮罐(BCBSCRY0SYSTEMS, 47/11, US);低温离心机；超净工作台(上海净化设备厂)；倒置显微镜(Nikon, Japan);温箱；振荡器。
[0026]实施例1
[0027]I)配制a -MEM培养液(该培养液中含有10% FBS，1%青链霉素)，置于37°C水浴锅中预热20分钟；
[0028]2) a -MEM培养液重悬MC3T3-E1后均匀接种于1cm培养皿中，十字结合八字法摇匀，放入37°C、5% CO2培养箱中进行培养；
[0029]3)每2天换一次液，3天后细胞达到80-90%汇合时；弃去原培养液，PBS洗净后，加入Iml 0.25% Trypsin-EDTA放入37°C、5% C02培养箱中I分钟，加入2ml培液终止消化，制成细胞悬液；
[0030]4)取生长状态良好的细胞，以接种密度为6xl04/cm2接种于六孔板a -MEM培养液预培养24小时使细胞贴壁；
[0031]6)实验分组:空白组、对照组、0.lmmol/L、0.2mmol/L0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、l.0mmoI/L,每组 3 个复孔。培养 24 小时后加入 0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.Bmmol /I,、
0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、l.0mmol/L 的过氧化氣；
[0032]7)分别于12、24、48小时去除原有培养液，用正常培养液清洗两次后再用PBS清洗一遍。去除过氧化氢对CCK-8的影响。每孔加入1ul的CCK-8(无血清、无抗生素的培液总体积为10ul)，37°C避光孵育3小时；
[0033]8)在450nm波长处，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，三组。
[0034]在倒置显微镜下可观察到出202刺激后的MC3T3-E1细胞，体积缩小，部分细胞呈碎肩状，贴壁能力减弱甚至消失。而且MC3T3-E1细胞发生上述改变的数量、程度和H2O2的浓度呈正比。
[0035]在不同的细胞浓度下，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。结果提示:与对照组相比，低浓度的(0.1-0.2mmOl/L)H20#H胞的死亡率没有显著性差异(P>0.05);高浓度的H202(0.3-0.7mmol/L)均会显著增加细胞死亡率并呈时间-浓度依赖性；过高浓度(>0.8mmol/L)的H2O2可造成90%以上的细胞死亡。
[0036]以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
【主权项】
1.一种MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法，其步骤包括， (1)将a-MEM培养液37-40°C预热20-25分钟；然后将a -MEM培养液重悬MC3T3-E1细胞，均匀，接种于培养皿中，摇匀，放入37°C、5%C02培养箱中进行培养； (2)每2-3天换一次液，3-5天后细胞达到80-90%汇合时弃去原培养液，胎牛血清洗净后，加入Iml浓度为0.25%Trypsin-EDTA放入37°C、5%C02培养箱中1-2分钟，加入2ml培液终止消化，制成MC3T3-E1细胞悬液； (3)取生长状态良好的MC3T3-E1细胞悬液接种于六孔板中，a-MEM培养液预培养24小时使细胞贴壁； (4)取步骤(3)中的浓度为0.1-1.0mmoI/L的成骨细胞液，培养20-28小时后加入浓度为0.1-1.0mmoI/L的过氧化氢溶液； (5)去除原有a-MEM培养液，用正常a -MEM培养液清洗2_4次后再用PBS清洗1_3次，每孔加入1ul的CCK-8毒性/增殖检测试剂，37°C避光孵育3小时； (6)在450nm波长处，测定各孔光吸收值即可。2.根据权利要求1所述的MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法，其特征在于:所述a -MEM培养液中含有质量浓度为10%的胎牛血清和质量浓度为1%的抗生素。3.根据权利要求2所述的MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法，其特征在于:所述抗生素为青链霉素。4.根据权利要求1所述的MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法，其特征在于:所述步骤(I)中的培养皿的厚度为10cm。5.根据权利要求1所述的MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法，其特征在于:所述步骤(I)均匀的方式为十字结合八字法。6.根据权利要求1所述的MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法，其特征在于:所述步骤(3)中的MC3T3-E1细胞悬液接种密度为6xl04/cm2。
【专利摘要】本发明涉及一种氧化应激测试方法，特别涉及一种成骨细胞氧化应激测试方法。首先将成骨细胞MC3T3-E1进行培养和诱导分化；取生长状态良好的MC3T3-E1细胞悬液接种于六孔板中，培养液预培养24小时使细胞贴壁；取浓度为0.1-1mmol/L的成骨细胞液，培养20-28小时后加入浓度为0.1-1mmol/L的过氧化氢溶液；去除原有培养液，用正常培养液清洗2-4次后再用PBS清洗1-3次，每孔加入10ul的CCK-8，37℃避光孵育3小时；在450nm波长处，测定各孔光吸收值即可。本测试方法有效测试出氧化应激刺激能引起细胞的死亡，并损害成骨细胞的正常功能，抑制成骨细胞的分化。
【IPC分类】C12Q1/02
【公开号】CN105018562
【申请号】CN201510396863
【发明人】宁光, 赵红燕, 刘建民, 孙立昊, 焦培林, 陶蓓
【申请人】上海交通大学医学院附属瑞金医院
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月8日