戴尔福特菌lw26及其在降解氯苯中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株新型氯苯高效降解菌--戴尔福特菌（Delftiatsuruhatensis) LW26及其应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 氯苯是苯环上只有氢原子和氯原子的单环芳香族化合物，具有溶解度低、疏水性 强等特点。近年来，作为一种重要的有机溶剂和化工生产的中间体，氯苯被广泛应用于塑 料、染料、医药、农药、有机合成等行业。由于其水溶性低且生物毒性大，对环境造成严重污 染。氯苯进入人体后可以抑制神经中枢，易与酶系统结合，有致畸致癌作用。由于使用广泛， 氯苯在多种环境介质中均具有较高的检出率，对人体健康和生态系统安全构成了一定的威 胁，氯苯已被美国环保署（EPA)列入优先控制污染物名单中。
[0003] 目前，针对这类污染物的排放控制，国内外科研工作者进行了大量研究，各种处理 方法应运而生，主要有吸附法、超声波法、膜分离法、催化氧化法、光化学氧化法、电化学法 等。近年来，生物法被证明在氯苯类化合物的净化中具有良好的应用前景。生物净化技术 是利用微生物代谢活动，将污染物转化为细胞代谢的能源、细胞组成物质及无害化的小分 子物质（如H20、0)2等），相较于其它方法具有高效、低耗，反应条件温和、二次污染小等优 点。
[0004] 利用生物技术降解氯苯的关键之一便是获得氯苯高效降解菌。目前，国内外学者 已在这方面做了大量研究，但是由于氯苯易挥发且难生物降解的特性，已分离得到的氯苯 降解菌种类还比较有限，此外，已分离得到的菌株降解效率还有待提高。如牛仙等在对一株 氯苯优势降解菌LysinibacillusfusiformisLW13进行降解条件优化的实验中发现，当氯 苯初始浓度为l〇〇mg/L时，氯苯的降解率达到最大，而当氯苯浓度达到180mg/L时，氯苯的 降解受到明显抑制（牛仙等.环境工程，2013,31(1):43-46.) ;2010年，张丽丽等发现一株 具有氯苯降解能力的RalstoniapickettiiH2,在氯苯浓度低于250mg/L时，H2可快速地 降解氯苯，细菌生长良好，而在250mg/L时，菌株生长和降解受到明显抑制（ZL101880642); 李明堂等筛选出的氯苯降解菌乙酸f丐不动杆菌（Acinetobactercalcoaceticus)，以初始 浓度为50mg/L的氯苯为唯一碳源和能源时，需经过120h才能将氯苯降解完全（李明堂 等?微生物学报，2010, 50 (5) : 586-592.)。
[0005] 经检索有关文献，尚未见用戴尔福特菌降解氯苯的报道。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明针对氯苯生物降解效率较低、微生物世代时间长的不足，提供了能高效降 解氯苯的戴尔福特菌LW26及其应用。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 本发明提供一株新菌株--戴尔福特菌（Delftiatsuruhatensis)LW26,保藏于 中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年3月15日，保藏编号CCTCCNo:M2015113， 地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
[0009] 本发明所提供的氯苯高效降解菌一一戴尔福特菌LW26是通过采集浙江工业大 学生物转化与生物净化实验室用于净化氯苯废气的生物滴滤塔中的生物膜，经分离、纯 化后获得。所述的戴尔福特菌LW26菌落特征如下：菌体呈短杆状，大小为（0. 6~0. 8) ymX(1. 0~1. 5)ym，无芽孢；在固体R2A培养基上菌落呈圆形，乳白色，凸起，边缘平整， 形态饱满，光滑湿润，菌苔沿划线生长；接触酶反应为阳性，V-P反应、甲基红反应、硝酸盐 还原反应、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验均为阴性，革兰氏染色阴性。
[0010] 本发明涉及所述的戴尔福特菌LW26在微生物降解氯苯中的应用。具体的，所述的 应用为：将戴尔福特菌LW26接种至含氯苯的无机盐培养基中，在温度23~40°C，pH4. 0~ 10. 〇的条件下（优选23~30°C，pH6. 0~9. 0)进行培养，实现对氯苯的降解。
[0011] 进一步，所述氯苯在无机盐培养基中初始浓度为100~500mg/L;所述戴尔福特 菌LW26以种子培养或发酵培养后的湿菌体经无机盐培养基稀释获得的0D_= 0. 1-0. 5的 菌悬液形式加入，菌悬液体积接种量为1-5 %，优选0D_= 0. 15的菌悬液体积接种量为 2 %。进一步，所述无机盐培养基组成为：CaCl2,0? 023g/L;MgS04,0? 2g/L; (NH4) 2S04, 2. 5g/ L;KH2P04,1.Og/L;Na2HP04,4. 5g/L;微量元素母液lmL/L;溶剂为水，pH7. 0 ~7. 5。所 述的微量元素母液组成为：FeS04 ? 7H20,1.Og/L;CuS04 ? 5H20,0. 02g/L;H3B03,0. 014g/L; MnS04 ? 4H20,0.lOg/L;ZnS04 ? 7H20,0.lOg/L;Na2Mo04 ? 2H20,0. 02g/L;CoCl2 ? 6H20,0. 02g/ L;溶剂为水。
[0012] 进一步，当菌液用量较小时，所述的戴尔福特菌LW26菌悬液可通过斜面培养、种 子培养和菌悬液制备三个步骤获得；当用量较大时，可通过斜面培养、种子培养、发酵液培 养和菌悬液制备四个步骤获得，具体过程如下：
[0013] (1)斜面培养：将戴尔福特菌LW26接种于R2A固体培养基，28~32°C培养48h， 获得斜面菌体；所述R2A固体培养基组成为：酵母粉，0. 50g/L;胰蛋白胨，0. 50g/L;干酪 素，0. 50g/L;葡萄糖，0. 50g/L;可溶性淀粉，0. 50g/L;丙酮酸钠，0. 30g/L;KH2P04,0 . 45g/L; MgS04,0 . 05g/L;琼脂，15 ~18g/L;溶剂为水，pH7. 2。
[0014] (2)种子培养：从步骤⑴斜面上挑取一接种环菌落接种至种子培养基中，28~ 32°C培养24~36h，获得种子液。所述的种子培养基为R2A液体培养基，除无琼脂外，其余 组分与r2a固体培养基相同。
[0015] (3)发酵培养：将步骤（2)获得的种子液以体积浓度5~10%的接种量接种至发 酵培养基，于28~32 °C，pH6. 0~8. 0条件下培养24~36h，获得发酵液。所述发酵培养基 组成为：酵母粉，〇? 5g/L;CaCl2,0. 023g/L;MgS04,0. 2g/L; (NH4)2S04,2. 5g/L;KH2P04,1. 0g/ L;Na2HP04,4. 5g/L;微量元素母液，lmL/L;溶剂为水，pH7. 0~7. 5,微量元素母液组成同无 机盐培养基中微量元素母液。
[0016] (4)菌悬液制备：将种子液（或发酵液）在6000rpm离心10min，弃上清液，用已灭 菌的无机盐培养基清洗菌体，然后在6000rpm离心10min，弃上清液，重复洗涤2次。将获得 的湿菌体用无菌无机盐培养基稀释获得所需浓度的菌悬液。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：在23~30°C，pH6. 0~9. 0条 件下，戴尔福特菌LW26在16h内可将无机盐培养基中100mg/L的氯苯完全降解，对氯苯的 最高降解浓度可达500mg/L。而专利申请CN101880642A提供的菌株H2氯苯耐受浓度仅为 250mg/L。李明堂等筛选出的氯苯降解菌乙酸f丐不动杆菌（Acinetobactercalcoaceticus) (李明堂等.微生物学报，2010, 50 (5) : 586-592.)，以初始浓度为50mg/L的氯苯为唯一碳 源和能源时，需经过120h才能将氯苯降解完全。相较于现有技术，本发明提供的戴尔福特 菌（DelftiatsuruhatenSiS)LW26具有降解速度快、耐受浓度高的特点，将在氯苯废气和废 水治理实践中发挥重要作用。 (四）
【附图说明】
[0018] 图1为戴尔福特菌LW26透射电镜照片。
[0019] 图2为戴尔福特菌LW26的系统发育树图。
[0020] 图3为温度对戴尔福特菌LW26生长和氯苯降解的影响。
[0021] 图4为pH对戴尔福特菌LW26生长和氯苯降解的影响。
[0022] 图5为不