气单胞菌yq及在酶法制备l-瓜氨酸中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株产L-瓜氨酸菌种--气单胞菌（Aeromonassp.YQ)以及采用该菌 株转化底物L-精氨酸生产L-瓜氨酸的工艺方法。 (二）
【背景技术】
[0002] L-瓜氨酸（L-citrulline)是人体尿素循环中的一种重要代谢产物，能够吸收并 清除有害的自由基从而起到抗氧化的作用。瓜氨酸可以使人的血管获得松弛，用于增强男 性性功能，以及治疗性功能障碍。维护建康的肺功能，提高脑力清晰度，有帮助脑神经细胞 具贮藏与调回讯息的功能。L-瓜氨酸可由L-精氨酸在精氨酸脱亚胺酶作用下，脱去亚氨 基生成。目前，生产L-瓜氨酸的方法主要有：发酵法、化学合成法、提取法和酶转化法。发 酵法生产的缺点是L-瓜氨酸产率低。化学合成法生产的产品中含有L-瓜氨酸的旋光对映 体D-瓜氨酸。提取法的生产工艺相对困难，产品很难纯化，因此成本比较高。酶转化法优 点是生产条件温和，产品中无D-型旋光对映体产生。酶转化法生产L-瓜氨酸是一种效率 高，成本低的生产方法，将在瓜氨酸生产中起到重要作用。转化能力较强的菌株将在未来瓜 氨酸生产中扮演重要角色。
[0003] 迄今尚没有气单胞菌（Aeromonassp.)酶转化法生产L-瓜氨酸的报道。 (三）
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一株可转化底物L-精氨酸生产L-瓜氨酸的新菌株一气单胞 菌（Aeromonassp.)YQ，及其酶法生产L-瓜氨酸的工艺方法。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 气单胞菌（Aeromonassp. )YQ，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No:M2015271，保藏日期：2015年5月3日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
[0007] 本发明菌株的获得：从浙江省杭州市勾庄西瓜大棚中采集的土壤样品，通过初筛， 复筛，获得具有转化底物L-精氨酸生产L-瓜氨酸能力的纯培养物。对该纯培养物进行了形 态和生理生化鉴定，将其鉴定为气单胞菌（Aeromonassp.)，命名为气单胞菌YQ(Aeromonas sp.YQ) 〇
[0008] 本发明还涉及所述的气单胞菌YQ在酶法制备L-瓜氨酸中的应用，具体所述的应 用为：以气单胞菌YQ经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以L-精氨酸为底物，以pH= 6醋 酸缓冲液为反应介质，在30°C~37°C，180r/min条件下进行转化反应，反应结束后，获得含 L-瓜氨酸的混合液，将混合液分离纯化，获得L-瓜氨酸。
[0009] 进一步，所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为10. 35g/L，所述底物的终浓度以缓 冲液体积计为l〇〇g/L。
[0010] 进一步，所述混合液分离纯化的方法为：将混合液用截留分子量为6000的超滤 膜过滤，透过液调整pH值至2后进行阳离子交换树脂柱层析（装填25mL湿732型树脂的 内径13_、高250_的玻璃吸附柱进行动态吸附，上柱温度为室温），以质量浓度1 %的氨 水作为洗脱液，以1. 2BV/h的流速进行洗脱，洗脱液用量为6倍树脂体积，将收集的洗脱液 用NKA-II树脂脱色，随后减压浓缩，再在浓缩液中加入无水乙醇进行结晶，晶体干燥，获得 L-瓜氨酸。
[0011] 本发明的有益效果主要体现在：本发明筛选得到一株具有转化底物L-精氨酸生 产L-瓜氨酸能力的菌株Aeromonassp.YQ，该菌全细胞可在30°C~37°C，180r/min，pH= 6的醋酸缓冲液中，作用3d，可将100g/L的底物L-精氨酸转化生成75g/L的L-瓜氨酸，产 品纯度约为47. 8%，整个工艺产品总收率为40%，为酶法生产L-瓜氨酸工业化奠定基础。 (四）
【附图说明】
[0012] 图1为菌株YQ在牛肉膏蛋白胨琼脂上的菌落形态图片；
[0013]图2为菌株YQ的透射电镜图片；
[0014] 图3为菌株YQ的革兰氏染色镜检图片（球状的菌株为阳性对照，杆状为菌株YQ);
[0015] 图4为菌株YQ的系统进化发育树；
[0016] 图5为L-瓜氨酸标准品高效液相色谱检测图谱（A)及L-瓜氨酸浓度计算的标准 曲线（B);
[0017] 图6为Aeromonassp.YQ不同天数的转化液高效液相色谱检测图谱（A)ld，（B) 2d， (C) 3d及转化液中L-瓜氨酸浓度的变化趋势（D)。 (五）
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0019] 实施例1:酶转化法生产L-瓜氨酸菌株的筛选
[0020] (1)菌株筛选
[0021] 采集浙江省杭州市勾庄西瓜大棚中采集的土壤样品，用生理盐水制成悬液，并用 生理盐水梯度稀释，涂布于筛选培养基平板，置于培养箱中，37°C培养24h，产生红色变色圈 较大的菌株即为初步筛选对象。将上述菌株接种于l〇〇ml发酵培养中，37°C，180r/min培养 24h，离心收集菌体转入60ml含终浓度100g/LL-精氨酸的pH为6的醋酸缓冲溶液中，置 于37°C摇床，180r/min转化Id。通过HPLC测定转化液中L-瓜氨酸的浓度，比较菌体转化 底物L-精氨酸生产L-瓜氨酸的能力。瓜氨酸出峰面积越大，表明菌株转化底物L-精氨酸 能力越强，L-瓜氨酸产量越高。其中YQ菌株L-瓜氨酸峰面积最大为4403,转化液中瓜氨 酸浓度达27g/L。保藏YQ菌株用于进一步试验。
[0022] 筛选培养基：蛋白胨lg/L，NaCl5g/L，KH2P04 0? 3g/L，L-精氨酸 10g/L，酚红0? 01， 琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH6. 7。
[0023] 发酵培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，L-精氨酸2g/L，溶剂 为去尚子水，pH= 7. 4。
[0024] (2)菌株的鉴定
[0025] 菌株YQ在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上形成的菌落（如图1所示）为圆形，微白色半 透明，表明光滑边缘整齐，中间凸起。通过透射电镜观察（如图2所示），菌株YQ呈短杆状， 两端钝圆，有一根极生鞭毛。菌体的大小为（〇. 2~0. 4)ymX(1~2)ym，革兰氏染色阴性 (图3所示），不产芽孢。菌株生理生化特性测定结果为：甲基红实验，V-P实验，运动性实 验，产硫化氢实验，明胶水解实验，接触酶实验阳性阳性。吲哚实验阴性。
[0026] 对该菌株YQ的DNA进行PCR扩增，以细菌16SrDNA通用引物，扩增到1439bp的 DNA片段，GenBank中登录号为（KR612330)，通过NCBI数据库进行BLAST比对，结果显示 该菌株与气单胞菌属（Aeromonas)的序列同源性最高，采用MEGA5. 05软件将该菌株的16S rDNA序列与Genbank中的若干个相关种的16SrDNA序列进行分析比对，以Plesiomonas shigelloides(NR_044827)为外群构建系统发育树，结果如图4所不，该菌株与Aeromonas veroniiB565strainB565(NR_102789)位于同一个系统发育的分支。根据该菌株形态特 征、生理生化特征及16SrDNA序列分析，并参考《常见细菌鉴定手册》，该菌株与Aeromonas 属特征相符，故将该菌株命名为气单胞菌YQ(Aeromonassp.YQ)，保藏于中国典型培养物保 藏中心，保藏编号：CCTCCNo:M2015271，保藏日期：2015年5月3日，地址：中国，武汉，武 汉大学，邮编430072。
[0027] 实施例2菌株的活化与发酵
[0028] 将气单胞菌YQ接种至斜面培养基，37°C培养24小时，获得斜面菌体。将斜面菌体 接种一环于装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，37°C，180rpm下培养24小时，获得种 子液。再以体积浓度4%的接种量将种子液接种于100ml发酵培养基中，37°C，180r/min培 养24h，将发酵液于6000rpm离心10min，收集菌体用灭菌生理盐水洗涤1~2次，获得湿菌 体。
[0029] 斜面培养基组成：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，