有机碳生物活性的分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子检测技术领域，尤其涉及一种有机碳生物活性的分析方法。
【背景技术】
[0002]海洋占地球表面积71%，已知人类活动产生的二氧化碳大约有1/3被海洋吸收，海洋碳循环对全球气候变化影响重大。
[0003]海洋中的有机碳主要是以溶解有机碳的形式存在的。溶解有机碳中约有95%是生物难以利用的惰性有机碳(Eichinger et al., 2006 ；Hansell et al.，2009)，可在海洋中储存长达数千年，其总量可与大气二氧化碳的总碳量相媲美，构成了海洋储碳。
[0004]海洋微型生物是海洋惰性有机碳主要来源，微型生物将活性有机碳转化为惰性有机碳，长期储存于海洋中(Jiao et al.，2010)。此生物过程对于应对全球变暖具有极其重要的意义。溶解有机碳的生物活性的鉴定对于评估有机碳在海洋储碳库中的作用具有重要意义。对于我们全面理解海洋在全球气候变化的作用意义重大。
[0005]然而，对于有机碳的生物活性却长期以来缺乏定量分析的方法，极大地制约了人们对海洋碳库及海洋储碳的过程与机制的认识。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种可实时定量分析有机碳对海洋细菌生物活性的有机碳生物活性的分析方法。
[0007]本发明包括以下步骤:
[0008]I)将有机碳配制成水溶液，得有机碳储备液；
[0009]2)将步骤I)得到有机碳储备液过滤灭菌。
[0010]3)将待分析的细菌接种到培养基Ml中进行前培养，使得菌体浊度达到0D600=1，将菌液离心，去上清，收集菌体，在菌体中加入NaCl，悬浊后再次离心，最后将菌体用NaCl悬浊，得菌体前培养液；
[0011]4)将储备液M2装入培养瓶中，再加入灭菌蒸馏水、有机碳储备液、菌体前培养液，将培养瓶加盖，放入微活性量热仪中培养，记录培养过程中的热量变化，进行有机碳生物活性分析。
[0012]在步骤I)中，所述有机碳可采用天然有机碳或人工合成有机碳；所述天然有机碳可选自糖类、氨基酸、有机酸等中的至少一种；所述有机碳储备液的PH值可为7，配制终浓度为10倍浓度的有机碳储备液。
[0013]在步骤2)中，所述过滤灭菌可用0.22 μπι已经灭菌的微孔滤膜过滤灭菌。
[0014]在步骤3)中，所述培养基Ml的组成可为IL中含有Bacto Peptone, 1.0g ；yeast extract, 1.0g ;KC1，0.3g ；MgS04.7H20，0.5g ；CaCl2.2H20，0.038g ；NH4CI, 0.3g ;K2HPO4, 0.3g ；NaCl, 20.0g ; ImL微量元素溶液，pH 7.8 ;所述微量元素溶液IL中含有FeSO4.7Η20，2.Ig ;H3B03，30mg ；MnCl2.4Η20，0.Ig ；CoCl2.6Η20，0.19g ；CuCl2.6H20，2mg ；ZnSO4.7Η20，0.144g ；Na2MoO4.2H20，36mg ;
[0015]所述离心的条件可为8000g离心5min ;所述在菌体中加入NaCl可在菌体中加入与菌液等量的质量百分浓度为0.8%的NaCl ;所述再离心的条件可为8000g再离心5min ;所述最后将菌体用NaCl悬浊可将菌体用与菌液等量的质量百分浓度为0.8%的NaCl悬浊。
[0016]在步骤4)中，所述储备液M2的成分为IL中含有KCl, 0.6g ;MgS04.7H20, 1.0g ;CaCl2.2H20, 0.076g ；NH4Cl, 0.6g ；K2HPO4, 0.6g ；NaCl, 40.0g ；2mL 微量元素溶液，pH 7.8 ;所述微量元素溶液 IL 中含有 FeSO4.7Η20，2.Ig ；H3BO3, 30mg ；MnCl2.4Η20，0.Ig ；CoCl2.6Η20，0.19g ；CuCl2.6H20，2mg ；ZnSO4.7H20，0.144g ；Na2MoO4.2H20，36mg，pH 7.8 ;所述储备液 M2、灭菌蒸馏水、有机碳储备液、菌体前培养液的体积比可为1: 0.6: 0.2: 0.2，培养瓶的容积为4ml，最终培养体系为2ml。
[0017]所述培养基Ml的成分无限制，可以根据细菌的不同而不同。培养基Ml为细菌最适培养基或菌保中心提供的用于特定细菌培养的培养基；储备液M2是将培养基Ml中的有机碳去除的培养基，培养基仅含有无机盐及微量元素。储备液M2需要配制成2倍的储备液，将配制好的培养基Ml和储备液M2经120度高压灭菌20min备用。
[0018]本发明的有益效果:本发明所提供的有机碳的生物活性的分析方法灵敏度高，对微生物培养过程的能量变化可以进行实时检测，容易操作，重复性好，精确度高。
【附图说明】
[0019]图1为本发明实施例1氨基酸生物活性的分析结果。
[0020]图2为本发明实施例2糖、醇及有机酸的生物活性的分析结果。
[0021]图3为本发明实施例3糖及氨基酸生物活性的分析结果。
【具体实施方式】
[0022]以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
[0023]本发明提供一种定量分析有机碳生物活性的方法，能够实时准确地定量分析有机碳对纯培养的微生物或环境微生物的活性。本发明具有操作简单、结果准确、灵敏度高、精确度高等优点，本发明在分析海洋有机碳库的性质方面具有良好的应用前景。
[0024]实施例1氨基酸生物活性的分析
[0025]1.1微活性量热仪的准备
[0026]微生物代谢活性的分析在微活性量热仪中进行。本实施例将温度设定为28°C，稳定仪器I?2h。
[0027]1.2有机碳储备液的准备
[0028]有机碳储备液的配制:本实施例分析了有机碳L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-缬氨酸和D-缬氨酸的生物活性。有机碳储备液的浓度均为10mM，pH调节为7.0。将此储备液用0.22 μπι已经灭菌的微孔滤膜过滤灭菌。
[0029]1.3细菌的前培养
[0030]本实施例采用的培养基Ml成分为IL含有Bacto Peptone, 1.0g ；yeastextract, 1.0g ;KC1，0.3g ；MgS04.7H20，0.5g ；CaCl2.2H20, 0.038g ;NH4C1，0.3g ;K2HPO4, 0.3g ;and NaCl, 20.0g ；lmL微量元素溶液，pH 7.8.微量元素溶液(L)的配方为:FeSO4.7Η20，2.Ig ;H3B03，30mg ；MnCl2.4Η20，0.Ig ；CoCl2.6Η20，0.19g ；CuCl2.6Η20，2mg ；ZnSO4.7Η20，0.144g ；Na2MoO4.2H20，36mg。
[0031]将配制好的培养基Ml，高压灭菌120 °C 20min。将交替单胞菌Alteromonasmacleodii (ATCC27216)，接种到培养基Ml，28°C 180rpm，培养过夜。菌体浊度达到0D600 ^ I左右。将菌液在8000g离心5min，去上清，收集菌体。在菌体中加入等量的0.8% Nacl悬浊，同样条件离心。此清洗过程重复两次。最后将菌体用等量的0.8% Nacl悬浊。作为菌体前培养液待用。接种及菌体的清洗过程均在超净台进行。
[0032]1.4细菌培养
[0033]储备液M2 成分为 IL 含有 KCl, 0.6g ；MgS04.7H20, 1.0g ；CaCl2.2H20, 0.076g ；NH4Cl, 0.6g ；K2HP04, 0.6g ；and NaCl，40.0g ；2mL 微量元素溶液，pH 7.8.微量元素溶液(L)的配方为:FeSO4.7Η20，2.Ig ;H3B03，30mg ;MnCl2.4Η20，0.Ig ;CoCl2.6Η20，0.19g ;CuCl2.6H2O, 2mg ；ZnSO4.7H20，0.144g ；Na2Mo04.2H20，36mg，pH 7.8。
[0034]取1ml储备液M2到4ml的培养瓶，加入0.6ml灭菌蒸馏水，0.2ml的有机碳储备液，0.2ml菌体前培养液。最终培养体系为2ml。将培养瓶加盖，压紧。放入微活性量热仪中培养。记录培养过程中的热量变化。
[0035]1.5有机碳生物活性分析
[0036]反应结束后，根据培养过程中的热量变化，进行有机碳生物活性的分析。
[0037]由本实施例结果可见，所分析的有机碳中L-谷氨酸和L-缬氨酸对海洋细菌Alteromonas macleodii (ATCC27216)是具有活性的，D-谷氨酸和D-缴氨酸则不具有活性。其活性大小为L-谷氨酸>L-缬氨酸>D-谷氨酸=D-缬氨酸。
[0038]本发明实施例1氨基酸生物活性的分析结果参见图1。
[0039]实施例2糖、醇及有机酸的生物活性的分析
[0040]2.1微活性量热仪的准备
[0041]在将温度设定到培养温度28°C，稳定仪器I?2h。
[0042]2.2有机碳储备液的准备
[0043]有机碳储备液的配制:本实施例分析了葡萄糖、乙酸、甘油、葡糖胺对海洋细菌Dinoroseobacter shibae DFL12 (DSM16493)的生物活性。有机碳储备液浓度为10%，pH调节为7.0。将此储备液用0.22 μπι已经灭菌的微孔滤膜过滤灭菌。
[0044]2.3细菌的前培养
[0045]本实施例采用培养基Ml成分为IL含有Bacto Peptone, 1.0g ；yeastextract, 1.0g ；NaCl 20g, KCl 0.3g,，MgSO4.7H20 0.5g, CaCl2.2H20 0.05g, NH4Cl0.3g, K2HPO40.3g,微量元素溶液lmL，pH 7.'.微量元素溶液(L)配方为:3.15gFeCl3.6H20, 4.36g Na2EDTA.2HZ0, 9.8mg CuSO4.5H20, 6.3