诱导普通小球藻zf藻株高效积累epa的方法
【技术领域】
[0001]本发明提供一种诱导普通小球藻ZF藻株高效积累EPA的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]小球藻(Chlorella)是一种常见的水生单细胞藻类，是绿藻小球藻科中的一个重要属，生态分布广泛，在海水和淡水中均有分布，目前包括大约10个种。小球藻细胞内含有丰富的蛋白质(干重的50%)、必需氨基酸、多糖、脂类(脂肪酸积累的结果)、叶绿素、胡萝卜素、和维生素等等，在保健食品、水产养殖(饲料添加剂)、化妆品、医药等领域内应用广泛，国内外市场供不应求。与美国、日本、以色列等国家相比，我国的小球藻工业化大规模培养水平相对滞后。普通小球藻ZF藻株是一种球形单细胞淡水藻类，通常生长在富营养化的水体中，但在人工培养条件下能大量生长繁殖。营养盐(氮、磷等)、光照、pH值、温度、微量元素(铁、锰、砸等)、碳酸氢铵、等因素均能影响小球藻生长。
[0003]二十碳五稀酸(eicosapentaenoic acid，EPA)，是一种n_3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)，即第I个双键出现在碳链甲基端的第3位。EPA在营养和医学上都具有重要的生理活性，可促进大脑发育、改善大脑功能、提高记忆力，对防治心脏疾病、动脉硬化、癌症、风湿关节炎、气喘和糖尿病等也有明显效果。目前主要从鱼油中获得，但鱼油来源的产品腥味较大，品质不高，产量不稳定。近来通过微藻提取纯化DHA、EPA已经成为国内外研究的热点。植物生长调节剂是植物体内产生的对植物生长发育起调控作用的化学物质，可分为五大类:生长素类、细胞分裂素类、赤霉素类、脱落酸和乙烯，而且这五大类生长调节剂在藻类中均已发现，植物生长调节剂对植物的生长发育具有明显的促进作用并已广泛用于农业生产中。植物生长调节剂作为一种植物生长调节剂，具有操作简单、诱导率高、速度快、造价低、损伤轻、无污染、安全性强等诸多优点。微藻是进行植物生长调节剂诱导的优良材料，其结构简单、生命周期短、光敏性强、代谢过程极易受环境影响，也容易被检测。
[0004]目前，国内外已经公开了一些提纯、制备EPA的方法工艺的相关专利技术，大多数是针对一些提纯、分离等技术改良的。如山东省海洋药物科学研究所公布了一种从海生物油脂中碱分离制备二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸或其酯类的方法(CN88101811)，其特征在于先用金属氢氧化物的乙醇溶液使油脂皂化，再用尿素的乙醇或甲醇等低碳数直链醇溶液处理所得到的不饱和脂肪酸。直接向除去尿素包合物后所得的高不饱和脂肪酸的醇溶液加无机酸进行催化脂化。在该发明的工艺中，把碱金属结晶法和尿素包合物法加以改进，并将其组合起来，用前法除去油脂中的饱和脂肪酸及胆固醇等脂溶性杂质，用后法除去低不饱和脂肪酸，由此制得高含量非异构化的EPA、DHA或其酯类衍生物。吕维学等提供了一种从海藻中提取EPA和DHA的方法(CN201110106175)。其步骤:将海藻原料粉碎，加入盐酸水解，经胶体磨研磨匀浆后，依次进过超滤、纳滤1、纳滤II，乙醇提取。如哈尔滨专利技术开发公司提供了一种以鱼油为原料制取二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸及其酯类的方法(CN88106038)，该方法的产品中EPA、DHA含量高，产品收率高。内蒙古金达威药业有限公司和厦门金达威集团股份有限公司提供了一种从双鞭甲藻发酵液中提取DHA不饱和脂肪酸的方法(CN200910159368)，其特征是:先将双鞭甲藻发酵液用质量浓度10-30%的盐酸溶液调节PH值至3-6，以发酵液体积2-5%、浓度为0.1-0.5%的无残留单体阳离子聚丙烯酰胺水溶液为絮凝剂絮凝，板框过滤得到滤饼，滤饼用5-10倍重量的破壁液破壁，破壁后用高速离心机实现渣、水相、油相三相分离，重复2-5次后基本无油相，合并油相并经水洗后即为含DHA毛油，DHA毛油进入五级连续分子蒸馏，前级的重组分直接进入后级进行蒸馏，绝对压力0.5-5Pa，温度120-140°C，最终得含DH的不饱和脂肪酸。湖北福星生物科技有限公司公开了一种用寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)工业化发酵生产二十二碳六稀酸油脂的方法(CN200910061833)。该方法提供一种用寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)原始菌株为菌种，工业化发酵生产二十二碳六稀酸油脂的方法，该方法能够低成本、大量生产高含量的甘油三酯型DHA油脂。上述相关提纯、制备DHA的方法工艺的相关专利技术虽然先进，但均未涉及植物生长调节剂诱导普通小球藻积累EPA的内容，且技术工艺相对复杂，且费用高，这无疑增加了生产成本和技术推广的难度。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种操作简单、速度快、造价低、无污染、安全性强的诱导普通小球藻ZF藻株高效积累EPA的方法。其具体的技术方案为:
[0006]一种通过诱导普通小球藻ZF藻株高效积累EPA的方法，其特征在于采用如下步骤:
[0007]I)制备藻液:在230C ±2°C、光强1900± 10lx和光暗比为12h/12h的条件下，采用1/4倍BGll培养基培养普通小球藻ZF藻株细胞28天到对数生长期，获得用于植物生长调节剂诱导的藻液，培养期间每14天加一次I倍浓度的BGll营养盐；
[0008]2)积累EPA:取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中，然后加入6-BA激素，植物生长调节剂6-BA在藻液中的浓度为1±0.05mg/L，于23°C ±2°C进行诱导处理14± I天，处理阶段每天人工摇藻不少于3次，相邻摇藻时间间隔不小于2小时，实现EPA在藻液中的积累。
[0009]本发明与现有技术相比，其优点是:
[0010]1、简单易行，原材料普通小球藻ZF藻株细胞易于培养，周期短，成本低。
[0011]2、能显著提高普通小球藻ZF藻株细胞内EPA含量，结果表明，诱导处理后藻细胞EPA含量为藻细胞干重的2.18—2.30%，分别是对照组细胞的8.15—8.59倍。
【具体实施方式】
[0012]实施例1，采用以下步骤:
[0013]I)制备藻液:在23°C、光强ISOOIx和光暗比为12h/12h的条件下，采用1/4倍BGll培养基培养普通小球藻ZF藻株细胞28天到对数生长期，获得用于植物生长调节剂诱导的藻液，培养期间每14天加一次I倍浓度的BGll营养盐；
[0014]2)积累EPA:取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中，然后加入北京索莱宝科技有限公司生产的植物生长调节剂6-BA，使植物生长调节剂6-BA在藻液中的浓度为lmg/L，于23°C进行诱导处理14天，处理阶段每天人工摇藻不少于3次，相邻摇藻时间间隔不小于2小时，实现EPA在藻液中的积累。
[0015]实施例2，采用以下步骤:
[0016]I)制备藻液:在24°C、光强20001x和光暗比为12h/12h的条件下，采用1/4倍BGll培养基培养普通小球藻ZF藻株细胞28天到对数生长期，获得用于植物生长调节剂诱导的藻液，培养期间每14天加一次I倍浓度的BGll营养盐；
[0017]2)积累EPA:取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中，然后加入北京索莱宝科技有限公司生产的植物生长调节剂6-BA，使植物生长调节剂6-BA在藻液中的浓度为0.95mg/L，于24°C进行诱导处理15天，处理阶段每天人工摇藻不少于3次，相邻摇藻时间间隔不小于2小时，实现EPA在藻液中的积累。
[0018]实验检测:
[0019]I)富集藻细胞:8000-9000rpm，4°C离心5-8分钟，得到澡泥，再将藻泥在_40°C冷冻干燥成藻粉。
[0020]2)提取油脂:利用索氏提取法对冷冻干燥后的藻粉进行提取，即得油脂。
[0021]3)对油脂甲酯化:首先向提取到的总油脂中加入3ml 0.4mol/L KOH/甲醇，60°C水浴Ih ;冷却后加入14% BF3.CH3OH溶液3ml，60°C水浴Ih ;再冷却后加入20 μ L 10mg/mL十九酸甲酯，Iml正己烷(色谱纯)和Iml饱和NaCl，加入无水硫酸钠后静置分层，Iml注射器抽取上层有机相，过滤后保存于1.5mL EP中。
[0022]4) EPA含量分析:采用气象色谱分析，色谱柱为HP-FFAP抗氧化交联石英毛细管柱，规格为30mX 0.25mmX 0.3m;进样口温度为260°C，分流比为50: 1;载气为高纯吧，柱流量为lmL/min，总流量55mL/min，压力114Kpa，线速度29.6cm/s，柱温由160°C以2°C /min的速度升至230°C，保持3min至出峰完毕；FID检测器，温度为230°C，进样量luL，得到气象色谱图。计算结果为:实施例1所得EPA含量为藻细胞干重的2.18%，是对照组细胞的8.15倍，实施例2所得EPA含量为藻细胞干重的2.30%，是对照组细胞的8.59倍。
【主权项】
1.一种诱导普通小球藻ZF藻株高效积累EPA的方法，其特征在于采用如下步骤: 1)制备藻液:在23°C±2°C、光强1900±1001x和光暗比为12h/12h的条件下，采用1/4倍BGll培养基培养普通小球藻ZF藻株细胞28天到对数生长期，获得用于植物生长调节剂诱导的藻液，培养期间每14天加一次I倍浓度的BGll营养盐； 2)积累EPA:取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中，然后加入植物生长调节剂6-BA，植物生长调节剂6-BA在藻液中的浓度为1±0.05mg/L，于23°C ±2°C进行诱导处理14± I天，处理阶段每天人工摇藻不少于3次，相邻摇藻时间间隔不小于2小时，实现EPA在藻液中的积累。
【专利摘要】本发明提供一种诱导普通小球藻ZF藻株高效积累EPA的方法，其特征在于采用如下步骤：1)制备藻液：在23℃±2℃、光强1900±100lx和光暗比为12h/12h的条件下，采用1/4倍BG11培养基培养普通小球藻ZF藻株细胞28天到对数生长期，获得用于植物生长调节剂诱导的藻液，培养期间每14天加一次1倍浓度的BG11营养盐；2)积累EPA：取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中，然后加入植物生长调节剂6-BA，植物生长调节剂6-BA在藻液中的浓度为1±0.05mg/L，于23℃±2℃进行诱导处理14±1天，处理阶段每天人工摇藻不少于3次，相邻摇藻时间间隔不小于2小时，实现EPA在藻液中的积累。本发明简单易行、成本低廉，能在短期内显著积累EPA含量。
【IPC分类】C12P7/64, C12R1/89
【公开号】CN105132480
【申请号】CN201510609108
【发明人】孟春晓, 李国强, 高政权, 吴冠勋, 郭艳芸, 付圣贵, 孙海风, 胡硕, 邓素贞, 沈义成, 陈国强, 张瑞豪
【申请人】山东理工大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月23日