一种睾丸酮丛毛单胞菌hy-08d的培养方法
【专利说明】-种睾丸鋼丛毛单胞菌HY-08D的培养方法
[000。（一）技术领域 本发明设及生物技术领域，特别设及一种睾丸酬丛毛单胞菌HY-08D的培养方法。
[000引仁）【背景技术】 k丙氨酸又名ka-氨基丙酸，易溶于水，微溶于乙醇，是生命体内与糖代谢密切相 关、需求量较多的氨基酸之一。近年来，随着研究开发的不断深入，丙氨酸在医药、食品及化 工等行业得到了广泛的应用。在医药工业中，丙氨酸是复合氨基酸注射液和输液的重要成 分，也是无机离子的补充剂和屯、肌功能增强剂。此外，心丙氨酸还是合成维生素Be及氨基 丙醇的重要原料。在食品工业中，心丙氨酸可W作为甜味剂和提鲜剂，改善人工甜味剂的 味感和有机酸的酸味。
[0003] k丙氨酸的生产方法由蛋白质水解提取法、发酵法逐步发展为用心天冬氨 酸-P-脱簇酶的酶转化法(固定化细胞法或游离整体细胞法)生产。目前，我国主要采用游 离整体细胞法生产k丙氨酸。其生产过程大致如下：首先培养产k天冬氨酸-P-脱簇酶 的菌体细胞，然后将k天冬氨酸加入到培养液中，k天冬氨酸在k天冬氨酸-P-脱簇酶 的作用下转化生成k丙氨酸，转化完成后经过滤、浓缩、结晶、干燥等工序得到成品k丙氨 酸。酶转化法效率的高低主要是由单位体积培养液中k天冬氨酸脱簇酶的酶活力决定的， 而提高单位体积培养液中的酶活性主要有两种方法：一是通过菌种诱变提高菌体的产酶能 力；二是通过培养基和培养条件的优化，提高单位体积培养液中产酶菌体细胞量和单位培 养液总酶活力。
[0004] 申请人拥有游离整体细胞转化生产k丙氨酸的专利菌株(睾丸酬丛毛单胞菌株 HY-08D，保藏编号为CGMCCNo. 6083)和技术(专利授权公告号：CN102690762B)，本发明在 原有技术的基础上，提供一种睾丸酬丛毛单胞菌株HY-08D新的培养方法，提高单位体积培 养液中k天冬氨酸脱簇酶活力，进而提高其转化效率。
[000引巨）
【发明内容】
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种睾丸酬丛毛单胞菌HY-08D的培养方法， 通过提高单位体积培养液中菌体细胞浓度和k天冬氨酸-0 -脱簇酶酶量，从而提高单位 体积细胞培养液的转化效率。
[0006] 本发明是通过如下技术方案实现的： 一种睾丸酬丛毛单胞菌HY-08D的培养方法，其特殊之处在于：包括W下步骤： (1) 菌株HY-08D斜面菌种活化：将低溫保存的菌株HY-08D接种到装有活化培养基试 管斜面中，28-32°C培养，挑取培养好的斜面菌苔接入另一支活化用试管斜面中，28-32°C培 养，再转接另一斜面，28-32 °C培养即得活化斜面菌种； (2) 制备菌株HY-08D-级种子液：取步骤（1)得到活化斜面菌种，接种到装有培养基的 S角瓶中，28-32°C、进行摇床培养，得到一级种子液； (3) 制备菌株HY-08D二级种子液：取步骤（2)得到的种子液W体积比1-1. 5%。接种 量转接到装有培养基的发酵罐中进行扩大培养，通风比0.15-0. 25vvm，相对溶解氧浓度 20-40%，根据溶解氧需求适当调节揽拌转速，罐压0. 08-0. 12MPa，28-32°C，培养，得到二级 种子液； (4)制备菌株HY-08D转化用培养液：将步骤（3)培养好的二级种子液W体积比5-10% 接种量转接到装有养培养基大发酵罐中进行扩大培养，控制通风比0. 10-0. 2vvm，相对溶 解氧浓度20-40%，根据溶解氧需求适当调节揽拌转速，罐压0. 08-0. 12MPa，28-32°C培养， 制得菌株HY-08D转化用培养液。
[0007] 步骤（1)中，培养时间均为24-36小时。
[0008] 步骤（2)中，摇床培养时间为12-18小时，摇床转速为180-20化pm。
[0009] 步骤（3)中，培养时间为10-16小时。
[0010] 步骤（4)中，培养时间为8-10小时。
[0011] 上述的活化斜面培养基所必需的营养物质包括（g/L):蛋白腺10 ;牛肉膏5 ;酵母 膏5 ;氯化钢5 ;琼脂20,pH7. 0-7. 2。
[0012] 上述菌株HY-08D培养所用培养基所必需的营养物质包括（g/L):天冬氨酸5-8 ;谷 氨酸钢7-12 ;葡萄糖3-8 ;酵母粉5-10 ;氯化钢3-6 ;玉米浆干粉5-12,抑6. 0-7. 0。更优 选的：天冬氨酸6-7 ;谷氨酸钢8-10 ;葡萄糖5-6 ;酵母粉6-8 ;氯化钢3-5 ;玉米浆干粉6-8， pH6.Oo
[0013] 上述细胞培养所用培养基是通过优化得到的，考察指标为单位体积培养液中的菌 体浓度和k天冬氨酸-0 -脱簇酶酶活力。
[0014] 上述菌株HY-05C培养的工艺控制参数(接种量、培养时间、通风量、相对溶解氧 浓度）是通过优化确定的，考察指标为转化用培养液中单位体积的菌体浓度和k天冬氨 酸-P-脱簇酶酶活力。
[0015] 本发明所述的睾丸酬丛毛单胞菌株HY-08D来自烟台恒源生物股份有限公司前 期选育的高产心天冬氨酸-P-脱簇酶的菌株(记载在授权号：CN102690762B，授权日： 2013. 10. 02,发明名称为："游离细胞法生物转化k天冬氨酸生产k丙氨酸的方法"。睾丸 酬丛毛单胞菌株HY-08D保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏编 号为CGMCCNo. 6083,保藏日期为2012年5月7日）。
[0016] 本发明的有益效果： 1、本发明通过菌株HY-08D培养基和培养条件的优化，提高了菌株HY-08D转化用培养 液中的k天冬氨酸-P-脱簇酶酶活力，进而提高后续转化效率和设备利用率。
[0017] 2、与原工艺相比，本发明菌株HY-08D培养工艺，通过对培养基和培养条件的优 化，单位体积培养液中菌体量较之前提高了 40%W上、天冬氨酸脱簇酶酶活力提高了 55%W 上，效果显著。
[0018] 3、与原工艺相比，本发明菌株HY-08D培养工艺，采用S级培养，二级培养罐接种 采用1-1. 5%。的接种量，有效降低扩培次数和染菌几率；=级培养罐采用5-15%的大接种 量，大幅缩短了培养时间，同时使得培养液中的菌体生长更加整齐，单位体积酶活力明显增 加，转化试验证明，相同体积的培养液转化效率提高60%左右。
[0019] (四）【附图说明】 附图1接种量对菌株HY-08D生长的影响； 附图2接种量对菌株HY-08D产酶的影响。
[0020] (五）【具体实施方式】 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[00川 实施例1 一种旨在提高单位体积培养液中菌体细胞浓度和k天冬氨酸-P-脱簇酶量的睾丸酬 丛毛单胞菌株HY-08D培养方法，包括W下步骤： 1、菌种活化 将冷冻保存的菌株HY-08D接种到装有活化培养基试管斜面中（培养基配方：氯化钢 5g/L，蛋白腺lOg/L，牛肉膏5g/l，酵母膏5g/l，琼脂20g/L，抑7. 0-7. 2)，30°C培养24小时， 挑取培养好的斜面菌苔接入另一支活化培养基试管斜面中，3(TC培养24小时，再转接另一 斜面，30°C培养24小时即得活化斜面菌种。
[0022] 2、菌株HY-08D培养用培养基配制 按W下配方配制细胞培养用培养基：天冬氨酸5g/l，谷氨酸钢lOg/l，葡萄糖5g/l，酵 母粉6g/l，氯化钢5g/l，玉米浆干粉6g/l，将上述原料加适量水溶解，然后用氨氧化钢调节 pH至6.0,定容，118°C下灭菌30分钟。
[0023] 3、一级种子液的制备 取上述新鲜活化斜面菌种分别接入化的S角瓶中，培养基装液量1000 mL, 200巧m， 30°C，摇床培养16小时，得到一级种子液。
[0024] 4、二级种子液的制备 将经上述培养获得的一级种子液（2X1000 mL)转接到装有1. 5m3培养基的2m3培养 罐中，调整罐压0. 08MPa，通风比0. 15vvm，通过调节揽拌转速维持培养过程中相对溶解氧 20%，30°C培养12小时，得到二级种子液。
[00巧]5、转化用培养液制备 将培养好的二级种子液（1.5m3)，转接到装有15m3培养基的20m3培养罐中，调整罐 压0. 08MPa，通风比0. 15vvm，通过调节揽拌转速维持培养过程中相对溶解氧20%，30°C培养 10小时，检测培养液k天冬氨酸-0 -脱簇酶活力为55280U/mL。
[002引实施例2 一种旨在提高单位体积培养液中菌体细胞浓度和k天冬氨酸-P-脱簇酶量的菌株HY-08D培养方法，包括W下步骤： 1、菌种活化 将冷冻保存的菌株HY-08D接种到装有活化培养基试管斜面中，30°C培养36小时，挑 取培养好的斜面菌苔接入另一支活化培养基试管斜面中，3(TC培养36小时，再转接另一斜 面，30°C培养36小时即得活化斜面菌种。
[0027] 2、菌株HY-08D培养用培养基配制 按W下配方配制细胞培养培养基：天冬氨酸6旨/1，谷氨酸钢8g/l，葡萄糖5旨/1，酵 母粉8g/l，氯化钢4g/l，玉米浆干粉8g/l，将上述原料加适量水溶解，然后用氨氧化钢调 节抑至6.0,定容，118 °C下灭菌30分钟。
[002引 3、一级种子液的制备 取上述新鲜活化斜面菌种分别接入化的S角瓶中，培养基装液量1200mL，200巧m， 30°C，摇床培养14小时，得到一级种子液。
[0029] 4、二级种子液的制备 将经上述培养获得的一级种子液（2X1200血）转接到装有I. 5m3培养基的2m3培 养罐中，调整罐压0.IMPa,通风比0. 15vvm，通过调节揽拌转速维持培养过程中相对溶解氧 30%，30°C培养10小时，得到二级种子液。
[0030] 5、转化用培养液制备 将培养好的二级种子液（1.5m3)，转接到装有15m3细胞培养培养基的20m3培养 罐中，调整罐压0.lOMPa，通风比0.lOvvm，通过调节揽拌转速维持培养过程中相对溶解氧 30%，30°C培养8小时，检测培养液k天冬氨酸-0 -脱簇酶活力为58650U/mL。该培养液用 于富马酸/天冬氨酸转化生产。
[00引]实施例3 一种旨在提高单位体积培养液中菌体细胞浓度和k天冬氨酸-P-脱簇酶量的菌株HY-08D培养方法，包括W下步骤： 1、菌种活化 将冷冻保存的菌株HY-08D通过转接斜面活化(培养基配方：氯化钢5g/l，蛋白腺IOg/L牛肉膏5g/l，酵母膏5g/l，琼脂20g/l，抑7. 0)，连续转接S次，培养溫度30°C，培养30小 时。
[0032] 2、菌株HY-08D培养用培养基配制 按W下配方配制细胞培养培养基：天冬氨酸8g/l，谷氨酸钢7g/l，葡萄糖3g/l，酵母粉 1〇邑/1，氯化钢6g/l，玉米浆干粉12g/l，将上述原料加适量水溶解，然后用氨氧化钢调节pH 至7.0,定容，118°C下灭菌30分钟。
[0033] 3、一级种子液的制备 取上述新鲜活化斜面菌种分别接入化的S角瓶中，培养基装液量1000 mL, 200巧m， 32°C，摇床培养18小时，得到一级种子液。
[0034] 4、二级种子液的制备 将经上述培养获得的一级种子液（2X1000 mL)接种到到装有1. 5m3培养基的2m3培 养罐中，调整罐压0. 12MPa，通风比0. 2vvm，通过调节揽拌转速维持培养过程中相对溶解氧 40%，28°C培养16小时，得到二级种子液。
[0035] 5、转化用培养液制备 将培养好的二级种子液（1.5m3)，转接到装有15m3培养培养基的20m3培养罐中，调 整罐压0. 12MPa，通风比0.Iv