胃癌的血浆miRNA生物标志物组合、其应用及胃癌早期诊断试剂盒的制作方法【
技术领域：
】[0001]本发明属于生物
技术领域：
中的miRNA及其应用，特别是设及胃癌的血浆miRNA生物标志物组合及其在胃肿瘤筛查、辅助胃肿瘤病理鉴定及临床诊断中的应用。【
背景技术：
】[0002]胃癌是常见恶性肿瘤之一，其死亡率位居第=。最近数据表明，在我国城市男性恶性肿瘤发病率和女性恶性肿瘤死亡率排名中，胃癌均位列第二，是严重威胁人类健康和制约经济社会发展的重大公共健康问题。胃癌的早期诊断意味着可W提早干预治疗，对患者的预后意义重大。目前，用于胃癌诊断主要依赖于内镜活检，而运种方法有创，给患者带来痛苦，且对实施此项技术的医师有较高要求。胃癌的无创检查方法主要是血清肿瘤标志物，例如癌胚抗原CEAXA199等，但是诊断的灵敏度和特异性较低。因此，寻找具有较高灵敏度和特异性的肿瘤标志物对胃癌患者的早诊早治具有重要意义。[0003]微小RNA(microRNA，miRNA)是一类平均长度约22(19-24)个核巧酸的非编码RNA，它广泛参与了机体正常生理活动调节。miRNA可W同时调节众多祀基因，其在细胞中的异常表达将会导致肿瘤的产生。miRNA不但能在肿瘤组织中检测到，而且在众多体液中也能稳定存在，能耐受酸碱等极端环境。不仅如此，有研究指出不同肿瘤患者血浆中miRNA的种类具有特异性，运种特性为利用miRNA作为非侵入性的诊断标志物进行早期胃癌检测提供了契机。在胃癌检测中，肖斌等发明了利用组织中的miR-3化检测（或诊断）胃癌的试剂盒，利用组织中的miR-3化检测（或诊断）胃癌具有灵敏度较高（达93.33%)的优点，但是此发明没有提及miR-3化诊断胃癌的特异性如何，也即区分正常人群的能力，另一方面，该试剂盒应用上受限，运是由于受检物癌灶组织标本需要经侵入性操作取得，况且如果能取得胃癌原发灶组织，完全可W通过病理来诊断（肖斌，邹全明，朱恩东，黎伯胜，毛旭虎，李娜，郭刚.一种用于诊断或检测胃癌的试剂盒[P].重庆：CN102002532A，2011-04-06.)。进一步的，张正东等发明了利用血浆/血清中miR-148a、miR-142、miR-26a和miR-195四种miRNA中的一种或几种诊断胃癌的试剂盒（张正东，王美林，康美云，刘桑，储海燕，全娜，吴冬梅，赵庆洪，薬伟达.检测胃癌的血清/血浆微小RNA标志物及其应用[P].江苏：CN103773761A，2014-05-07.)，在此种试剂盒中，U6基因作为内参，但已有文献报道U6基因在血浆中表达并不稳定，因而WU6基因作为内参基因计算W上四种miRNA的含量就有可能产生误差，进而影响诊断的准确性度enzF,RoderburgC,VargasCD,etal.U6isunsuitablefornormalizationofserummiRNAlevelsinpatientswithsepsisorliverfibrosis.ExpMolMed.2013.45:e42;XiangM,ZengY,YangR,etal.U6isnotasuit曰bleendogenouscontrolforthequ曰ntific曰tionofcircul曰tingmicroRNAs.BiochemBio地ysResCommun.2014.454(1):210-4.)，另外，此发明是利用四种miRNA中的一种或几种诊断胃癌，但是，发明人并没有说明何时采用一种miRNA诊断，何时采用两种、=种或四种miRNA联合诊断，也没有说明何时采用血清诊断，何时采用血浆诊断，而且如果当用一种miRNA诊断胃癌的结果与用多种miRNA联合诊断胃癌的结果不一致时，也就是说若一种miRNA诊断结果判定为胃癌，而多种miRNA联合诊断同一受试者结果判定为非胃癌时，此时该如何判定诊断结果，此发明中均未说明，无疑会给使用者造成困扰。因此，迫切需要一种准确、特异、灵敏的利用miRNA诊断胃癌的方法及其专用引物、探针与试剂盒。【
发明内容】[0004]本发明的一个目的是提供一组用于胃癌早期诊断和罹患风险评估的血浆miRNA标志物组合，利用该血浆miRNA生物标志物组合可用于诊断受试者是否罹患胃癌并进行罹患风险评估。[0005]本发明所提供的胃癌的血浆miRNA生物标志物组合，包括W下血浆miRNA:miR-190a、miR-331-5p、miR-362-化和miR-369-化，W及miR-16作为内参。其中，miR-190a的序列如序列表中SEQIDNO.1所示，miR-331-5p的序列如序列表中SEQIDNO.2所示，miR-362-化的序列如序列表中SEQIDNO.3所示，miR-369-化的序列如序列表中SEQIDNO.4所示，miR-16的序列如序列表中SEQIDNO.5所示。[0006]本发明的miRNA生物标志物组合能在血浆中稳定存在，其在正常人血浆、胃良性病变患者血浆和胃恶性肿瘤患者血浆中的表达量具有差异性，因此，能用于胃肿瘤筛查、辅助胃肿瘤病理鉴定及临床诊断。因此，本发明的miRNA生物标志物组合在胃肿瘤筛查、辅助胃肿瘤病理鉴定及胃癌早期临床诊断中的应用也属于本【
发明内容】。[0007]W上述血浆miRNA生物标志物组合为祀标，用基于化qMan探针的实时巧光定量PCR技术可用于诊断胃癌。[0008]因此，上述血浆miRNA组合作为胃癌早期联合诊断生物标志物的应用也是本
发明内容。[0009]在所述PCR检测中所述miR-190a、miR-331-5p、miR-362-化和miR-369-化各生物标志物联合使用按下式系数分配用于对胃癌进行判断：[0010]Y-6.302XAmiR1903+18.486XBmiR331Sp+50.194XCmiR3623P+16.113XDmiR3脚化[0011]其中，AmiKigOa是miR-igOa在血浆中的表达量（2&&G准），BmiK33i日p是miR-33l-5p在血浆中的表达量（2&值），CmiK3日23P是miR-362-化在血浆中的表达量（2值），DmiR3693P是miR-369-化在血浆中的表达量（2&值）。[0012]本发明的另一目的是提供一种用于胃肿瘤筛查、辅助胃肿瘤病理鉴定及临床诊断的miRNA试剂盒。[0013]本发明所提供的miRNA试剂盒，包含与所述miRNA生物标志物组合PCR检测相关的引物，分别为：[0014]miR-190a的RT引物（序列表中SEQIDNO.6所示）和F端引物（序列表中SEQIDNO.11所示）；[0015]miR-331-5p的RT引物（序列表中SEQIDNO.7所示）和F端引物（序列表中SEQIDNO.12所示）；[0016]miR-362-化的RT引物（序列表中SEQIDNO.8所示）和F端引物（序列表中SEQIDNO.13所示）；[0017]miR-369-化的RT引物（序列表中SEQIDNO.9所示和F端引物（序列表中SEQIDNO.14所示）；[001引内参miR-16的RT引物（序列表中SEQIDNO.10所示）和F端引物（序列表中沈QIDNO.15所示）；W及[0019]通用R端引物（序列表中SEQIDNO.16所示）。[0020]上述试剂盒具体可包括W下引物和探针：[002。1)用于合成cDNA的逆转录引物：是特异性的RT茎环引物，miR-190a的RT引物序列如序列表中SEQIDNO.6所示，miR-331-5p的RT引物序列如序列表中SEQIDNO.7所示，miR-362-化的RT引物序列如序列表中SEQIDNO.8所示，miR-369-化的RT引物序列如序列表中SEQIDNO.9所示，miR-16的RT引物序列如序列表中SEQIDNO.10所示；[002引。用于实时巧光定量PCR的引物和化qMan探针：miR-190a的F端引物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO.11所示，R端引物（反向通用引物）序列如序列表中SEQIDNO.16所示，haMan探针序列如序列表中SEQIDNO.17所示；miR-331-5p的F端引物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO.12所示，R端引物（反向通用引物）序列如序列表中沈QIDNO.16所示，TaqMan探针序列如序列表中沈QIDNO.18所示；miR-362-化的F端引物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO.13所示，R端引物（反向通用引物）序列如序列表中SEQIDNO.16所示，TaqMan探针序列如序列表中SEQIDNO.19所示；miR-369-化的F端引物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO.14所示，R端引物（反向通用引物）序列如序列表中SEQIDNO.16所示，TaqMan探针序列如序列表中SEQIDNO.20所示；miR-16的F端引物（正向引物）序列如序列表中SEQIDNO.15所示，R端引物（反向通用引物）序列如序列表中SEQIDNO.16所示，TaqMan探针序列如序列表中SEQIDNO.21所示。[0023]所述化qMan探针为经过巧光标记的，其5'端标记有报告巧光基团，如肥X、FAM等，优选为FAM，其3'端标记有泽灭巧光基团，如ECLIPSE、TAMRA、MGB等，优选为MGB。[0024]所述试剂盒还包括W下用于逆转录反应体系的试剂（可检测100次）：lmL逆转录缓冲液（10X)，100yL脱氧核巧酸（lOOmM)，50yLRNA酶抑制剂（20U/yL)，150yL逆转录酶巧0U/yL)。[00巧]所述试剂盒还包括W下用于实时巧光定量PCR反应体系的试剂（可检测100次）：1.5mlPCR预混液（2X)，100yLF端引物液（20yM)，100yLR端引物液（20yM)，20yl；raqman探针引物（10yM)和2血无核酸酶水。[0026]W上述血浆miRNA生物标志物组合为祀标，使用上述miRNA试剂盒基于化qMan探针的实时巧光定量PCR技术诊断胃癌的方法，可进行W下操作：[0027]1)制备待测人血浆样本，W健康人血浆样本作为正常对照；[002引。提取血浆总RNA;[0029]3)将血浆总RNA逆转录成cDNA;[0030]4)WcDNA为模板，在miR-190a、miR-331-5p、miR-362-3p、miR-369-3p和miR-16(内参）的特异引物和化qMan探针的引导下，用基于化qMan探针的实时巧光定量PCR技术检测11111?-190日、11111?-331-59、11111?-362-化、11111?-369-化和11111?-16(内参）在待测人血浆和健康人血浆中的表达量采用2表示待测样本中目的miRNA表达量相对于正常对照组变化的倍数：[00引]2&&ct值中，Act=Ct目的miRNA-Ct内参miRNA，[003引AACt=ACt待巧U样本-ACt正常对照；[003引W采用2相对定量法分析数据，Logistic回归方程（判断公式）：Y=6.302XAmiRI90a+18.486XBmiR3315p+S0.igAXCmiR3623p+lG.llSXDmiR3693p，其中，AmiR190a是miR-190a在血浆中的表达量（2准），BmiK33i5p是miR-331-5p在血浆中的表达量（2值），CmiR3623P是miR-362-化在血浆中的表达量（2值），DmiR3693P是miR-369-化在血浆中的表达量（2值），AAct=(CtmiRNA-CtmiR-16)Cancer-(CtmiRNA-CtmiR-16)MeanNormal，CtmiRNA和CtmiR-16分别代表用基于化qMan探针的实时巧光定量PCR技术检测到的目的mi当前第1页1 2 3 4