一种血浆miRNA生物标志物的用途
【专利摘要】尘肺是长期吸入粉尘所致的以肺间质纤维化为主的全身性疾病。本发明的目的是提供一种制备miRNA生物标志物在早期诊断尘肺以及诊断尘肺病程状态中的用途，其灵敏度和特异性高，较为准确可靠的用于尘肺早期筛查、早期诊断及预后。
【专利说明】—种血浆miRNA生物标志物的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种血浆miRNA生物标志物的用途。
【背景技术】
[0002]尘肺是长期吸入粉尘所致的以肺间质纤维化为主的全身性疾病。卫生部公布的2004年度我国职业病统计报告显示，全国累计尘肺病例数58万人，可疑尘肺病例60多万，新发尘肺病人目前仍以每年1.5万至2万例的速度增长。矽肺患者占了尘肺病例的近80%。近年来矽肺病的流行呈现出群发性、低龄化、致残率高以及死亡率高的新特点，局部严重的地区已经出现矽肺村和寡妇村。矽肺不但是中国危害最严重的职业病，而且已经成为社会重大的公共卫生问题，也给矽肺的防治工作带来了新的挑战。
[0003]尘肺作为典型的重大职业病其致病因素比较清楚，因此，可以采取有效的对策来预防。控制其作业现场的粉尘的浓度，减少作业人员的接触水平是预防尘肺发生的最根本途径。然而，由于客观条件的种种限制，矽肺的发病率依然居高不下，所以对职业高危人群实施早期健康监护就显得尤为重要。寻找尘肺诊断(筛检)的尘物标志物，并建立以上重大职业病早期方便、快捷的、灵敏度、特异性俱佳的诊断(筛检)模式，对于早期发现疑似病人，早治疗，降低尘肺等重大职业病的发病率，具有重大的经济和社会效益。
[0004]目前，尘肺的诊断手段主要依靠职业史、临床症状、体格检查、影像学检查、病理诊断及相关组织特异性检查(尘肺的支气管镜与肺泡灌洗液检查)等传统技术，但运用这些技术与方法，发现尘肺 患者时，其肺组织纤维化病变已无法逆转、也无药物可以治疗。因此，为尘肺的早期诊断寻找微创、高敏感性或特异性的早期筛查生物标志物已成为一个急需解决的问题。重大职业病的生物标志物是在职业接触人群中进行医学监护的生物指标，用于识别罹患该职业病的早期患者，在职业接触人群中进行早期生物监测具有重大实用价值。
[0005]随着人类后基因组计划的进一步开展，占人类基因组99%的非编码序列越来越引起科学家的关注，其中最引人注目的是microRNA(miRNA)的发现。miRNA是一类全长为19-25nt的单链小分子RNA，由茎环结构的转录前体加工而成。miRNA与靶标基因3' UTR结合，通过降解mRNA或抑制其翻译，从而在转录后对靶标基因的表达水平进行调控。miRNA是新近发现的、高度保守的、非蛋白编码的小RNA，在转录后水平抑制靶基因表达。成熟miRNA通过与靶mRNA3’ -非翻译区域(UTR)的碱基配对来调控基因的表达，可以导致靶mRNA的降解或者翻译的抑制。生物信息学研究表明，单个miRNA分子能够与数百个功能各异的目标mRNA相结合而发挥调节作用。因此，数以百计的miRNA可能参与人类所有的生理与病理活动，与疾病的发生、发展息息相关。miRNA调节细胞的分化、增殖及凋亡，并且在疾病的发生、发展中起关键作用，其有望成为重大疾病发生、诊断和预后的重要候选标志物。但是将其应用于尘肺的早期诊断还没有相应的研究。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种制备miRNA生物标志物在早期诊断尘肺中的用途，所述的 miRNA 为:miR-21、miR_200c、miR-16、miR-206、miR-155、miR_29a、miR-204,本发明的另一个目的是提供一种制备miRNA生物标志物在诊断尘肺病程状态(即疾病的发展过程、严重程度)中的用途，所述的miRNA为:miR-204、miR-21。本发明灵敏度和特异性高，可较为准确可靠的用于尘肺早期筛查、早期诊断及预后。
[0007]这7个已有的miRNA的氨基酸序列为:
[0008]miR-21:
[0009]UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGMUCUCAUGGCMCACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA
[0010]miR-206:
[0011 ] UGCUUCCCGAGGCCACAUGCUUCUUUAUAUCCCCAUAUGGAUUACUUUGCUAUGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGGUUUCGGCAAGUG
[0012]miR-155:CUGUUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGUUUUUGCCUCCAACUGACUCCUACAUAUUAGCAUUAACAG
[0013]miR-29a:AUGACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAGAGUCMUAUMUUUUCUAGCACCAUCUGAMUCGGUUAU
[0014]miR-204:
[0015]GGCUACAGUCUUUCUUCAUGUGACUCGUGGACUUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCUGAGAAUAUAUGAAGGAGGCUGGGAAGGCAAAGGGAC⑶UCAAU腳CAUCACUGGC
[0016]miR-200c:CCCUC⑶CUUACCCAGCAGUGUUUGGGUGCGGUUGGGA⑶CUCUAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGAGG
[0017]miR-16:
[0018]⑶CAGCAGUGCCUUAGCAGCACGUAAAUAUUGGCGUUAAGAUUCUAAAAUUAUCUCCAGUAUUAAC腳GCUGCUGAAGUAAGGUUGAC
[0019]本发明通过对尘肺不同分期病人和健康志愿者血浆miRNAs表达谱分析，获取血浆中尘肺差异表达的miRNAs并加 以验证，确定用于尘肺筛查诊断的候选血浆miRNA生物标志物。采用病例对照研究，依据TaqMan方法，用低密度芯片(TLDA)筛选、RT-qPCR验证的筛选方法最终确定用于尘肺筛查诊断的候选血浆miRNA生物标志物，并验证其作尘肺筛查诊断的生物标志物的可行性，便于在人群中开展普查，以期提高尘肺的早诊率，确定高危人群，进而为尘肺病因学研究和最终制定尘肺早期预防措施提供理论依据，为寻找可作为尘肺患者预后的miRNA标志物，确定简单易行、微创价廉的职业病早期筛查生物标志物提供理论和技术基础。
[0020]本发明是通过如下几个步骤进行验证和实验的:
[0021]1.对4组TaqMan低密度芯片的实验结果加以整理，根据尘肺病情发展的特点和差异比较的结果，在152例病例和152例正常对照血浆中，通过TaqMan低密度芯片方法筛选出在正常对照组、I期尘肺组、II期尘肺等三组之间血浆中有一定表达差异的10个候选miRNAs，确定10个miRNAs作为候选血浆生物标志物检测验证。将miRNAs表达值< 35视为有效扩增，对照组有323个miRNAs扩增，良性组有285个miRNAs扩增，早期组有314个miRNAs扩增，晚期组有276个miRNAs扩增。采用TaqMan技术，用RT-qPCR方法在I期尘肺130例，II期尘肺22例和对照152例血浆样本中进行验证，其中7个miRNAs均可在血浆中检测到有效表达，7 个 miRNA 分别为:miR_21、miR_200c、miR-16、miR-206、miR-155、miR_29a、miR-204。
[0022]2.对有尘肺有早期筛查和诊断价值的7个血浆miRNAs进行灵敏度和特异性的考察，7个miRNAs有统计学意义，各miRNAs对于尘肺与正常人群诊断的效能最高，ROC-AUC为
0.566-0.904。多个血浆miRNAs联合建立的尘肺诊断模型，其ROC-AUC达到0.910，可改善尘肺早期筛查诊断的灵敏度和特异性。
[0023]3.进一步通过1、II期尘肺间的比较:结果显示miR-204、miR-21在1、II期尘肺中的表达量存在差异性；由此可以看出miR-204、miR-21在1、II期尘肺中可以有效筛查出尘肺的病程状态，并进一步得知患病的严重程度。
[0024]本发明的具体实验过程、实验步骤和结果如下:
[0025]I研究对象
[0026]病例组为在天津市工人疗养院就诊的尘肺病人152例，均为男性，包括I期尘肺130例，II期尘肺22例。正常对照组选取同社区健康体检人员，体检合格，无接触矽尘，无心血管、肝肾等器质性病变以及肺部其它疾病的152名男性。所有样本采集前告知采集目的并获得患者同意病理组与对照组的年龄、吸烟、饮酒等因素的分布差异均无统计学差异(P > 0.05)。治疗前空腹取静脉血5mL，并同意接受流行病学调查。
[0027]正常对照选取同期社区健康查体人员，体检合格并无肺部疾病、既往无肺部病史的健康女性，按照与病例组人群年龄1:1匹配，确定健康对照组30例，同意贡献空腹取静脉血5mL，并接受流行病学调查。
[0028]2.实验方法
[0029]2.1血浆总RNA的 纯化
[0030][I]无菌采集实验个体外周血，每管5ml，采集的血样常温下保存不超过lh，之后3500*g离心10min，将血清与血细胞分离，装入1.5ml EP管中，-80°C保存；
[0031][2]每例取110 μ L血浆移入去核酸酶离心管，组成4组混合血浆样本，14，OOOg,4°C低温离心10分钟；
[0032][3]每组混合血浆样本取上清液ImL置于一新的去核酸酶离心管中，加入3mLTRIzol LSReagent,涡漩震荡混匀至少15秒，室温孵育5分钟以上；
[0033][4]每份混合液中加入8.5 μ L外源性参照物celniR-39 (5fmol/μ L)，使最后终浓度为0.85fmol/μ L，涡漩震荡混匀；
[0034][5]每份混合液中加入ImL氯仿(CHCl3)，涡漩震荡混匀至少I分钟，12，000g、4°C低温离心至少15分钟，小心吸取上清液置于一新的去核酸酶离心管中(应获取上清液约
2.5mL)；
[0035][6]每份上清液中加入1.5倍体积的无水乙醇，反复吹打，充分混匀；
[0036][7] 4组上清液每组各一个收集柱，每次转移700 μ L上清液过柱，13，OOOg室温离心30秒，弃去流出液，如此反复直至每份上清液全部过柱完毕；
[0037][8]每个收集柱加入700 μ L RffT洗液，13，OOOg室温离心I分钟，弃去流出液；
[0038][9]每个收集柱加入500 μ L RPE洗液，13，OOOg室温离心I分钟，弃去流出液，再重复洗涤I次；
[0039][10]将收集柱转移到新的收集管上，13，OOOg室温离心2分钟，干燥收集柱；
[0040][11]将收集柱打开上盖室温晾I分钟后，转移至新的1.5mL无酶收集管上；
[0041][12]每个收集柱加入50 μ L 60°C预热的DNase/RNase free water,室温静置5分钟；[0042][13] 13，OOOg室温离心2分钟，将洗脱液再次加入原收集柱以溶解柱内残存RNA，
室温静置2分钟；
[0043][14] 13，OOOg室温离心2分钟，将洗脱液标记储存于_80°C冰箱。
[0044][15]验证时每个样本初始血浆量为250 μ L，离心后取200 μ L血浆加入800 μ LQIAzol LysisReagent参与裂解，加入5 μ L外源性参照物celiiR-39混匀，加入200 μ L氯仿涡漩震荡，离心吸取上清液约600 μ L，过柱、洗涤步骤同[6]-[11]，最后用30yL洗脱。
[0045]2.2逆转录
[0046][I]冰上溶解总 RNA 样品和TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit 的各
试剂，稍混匀离心，冰上配置逆转录反应体系如下:
[0047]
【权利要求】
1.一种制备miRNA生物标志物在早期诊断尘肺中的用途，所述的miRNA为:miR_21、miR_200c、miR-16、miR-206、miR-155、miR_29a、miR-204。
2.一种制备miRNA生物标志物在诊断尘肺病程状态中的用途，所述的miRNA为:miR·204、miR-21。·
【文档编号】C12Q1/68GK103849677SQ201210515833
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月6日 优先权日:2012年12月6日
【发明者】王延让, 张明, 杨德一, 王倩, 李建国 申请人:王延让, 张明