一种鉴别枣花蜜花源的特征蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种鉴别要花蜜特征蛋白质及其分离纯化，属于食品科学领域。
【背景技术】
[0002] 蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而 成的天然甜物质。蜂蜜营养丰富且成分复杂，含有多种必需氨基酸、维生素、酪类化合物、 黄酬类物质等，因而具有多种生物活性，如抗氧化、抗菌、加速创伤修复和提高免疫力，对肝 炎、胃病、贫血和高血压等具有一定的辅助疗效作用。由于蜂蜜的感官特征易受加工、胆存 和结晶等因素影响，不同种类蜂蜜的主要成分间含量不显著，传统的方法难W辨别蜂蜜品 种。此外，采自不同花源的蜂蜜之间的价格差异较大，一些不法生产商W次充好、W假乱真 为其谋取暴利，严重影响到了中国蜂蜜产业的健康发展和消费者的权益保护。因此亟需开 发一种快速、简单和准确的方法来鉴别蜂蜜真伪。 阳00；3] 要花蜜如/6成成如必/心.）是我国比较大宗的蜂蜜产品，也是消费群体比 较推崇的蜂蜜类型之一。要花蜜的颜色从浅班巧色到深班巧色不等，略带微红；质地粘稠， 不易结晶；气味浊香，有特殊的浓郁气味(要花香味)。要花蜜主要产于我国华北和西北地 区，其中陕西、山西和河南=省产量较大。要花蜜内含丰富的葡萄糖、果糖和多种维生素及 矿物质，具有抗菌消炎，促进组织再生，解毒保肝，强屯、造血，调节神经、改善睡眠，抗衰强身 等特殊功效。然而蜂蜜的生产易受到植物地理位置、植物花期、气候、蜂群强弱W及取蜜时 间等的影响，使得要花蜜的产量不稳定，W致要花蜜的市场供不应求。因要花蜜与其他蜂 蜜(如荆条蜜）在色泽、气味和成分上较为相似；另外，蜂蜜造假不断地向规模化和专业化发 展，假蜂蜜产品的感官指标和部分理化指标与天然蜂蜜产品极为相似，已经很难通过运些 指标对蜂蜜的真伪进行鉴别。
[0004] 为了完善蜂蜜真伪的鉴别技术，需要对蜂蜜中微量且特异性强的组分进行分析。 蜂蜜中蛋白质的含量约为蜂蜜总质量的0.2-1.0%，主要来自蜜蜂化及蜜源植物的花粉或花 蜜，是蜂蜜中重要的成分。蜂蜜蛋白质作为蜂蜜特有的内标物，根据其之间的差异可W确定 蜂蜜的来源。
【发明内容】
阳〇化]本发明的目的是提供一种分离纯化的要花蜜特征蛋白。
[0006] 本发明的另一个目的是提供一种分离纯化和鉴定要花蜜特征蛋白质的方法。
[0007] 本发明的实现过程如下： 一种要花蜜蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo. 1所示。
[000引上述要花蜜特征蛋白质通过SDS-PAGE电泳获得，其分子量在17ku左右。分离权 利要求1所述要花蜜蛋白的方法，其特征在于，包括步骤： (1)要花蜜粗蛋白的制备 称取要花蜜样品，按照质量体积比1:1溶于蒸馈水中，5000g离屯、10分钟，收集上清液 并定容得要花蜜粗蛋白溶液，于4°C保存； (2)SDS-PAGE 将要花蜜粗蛋白溶液与样品溶解液按体积比1:1混合均匀，沸水煮沸3-5分钟；使用 12%的分离胶和5%的浓缩胶恒压电泳，样品在浓缩胶中用低压70-80V，当样品进入分离胶 界面时调节电压至120V，直至样品达到分离胶底部上方约Icm处，关闭电源，结束电泳；然 后将胶片取下，用蒸馈水清洗，加入染色液染色，染色后，加入脱色液进行脱色，直到胶中的 蛋白质条带清晰可见。
[0009] 上述要花蜜蛋白的方法中，步骤（2)样品溶解液、电极缓冲液、染色液和脱色液的 具体配制方案如下， (1) 样品溶解液：在50mmol/L化is-HCl缓冲液（pH6.8)中含有1%SDS、1%琉基乙醇、 !〇〇/〇甘油和0. 02%漠酪蓝，配制50ml样品缓冲液； (2) 电极缓冲液：分别称取3.02gTris、14.42gGly、lgSDS，溶于蒸馈水中并定容至 1000 ml; (3) 染色液：称取0. 25g考马斯亮蓝R-25,溶于100mL固定液，固定液为含50%乙醇 和10%冰乙酸的水溶液； (4) 脱色液：含20%乙醇和7%冰乙酸的水溶液。
[0010] 发明人研究发现，要花蜜的蛋白质电泳图谱与其他7种蜂蜜（即油菜蜜、洋槐蜜、 荆条蜜、锻树蜜、龙眼蜜、构杞蜜和葵花蜜）的蛋白质图谱存在显著差异巧日图1)。其中~ 17ku蛋白质谱带是其他7种蜂蜜所不含有的且该蛋白质的分子量与其他蛋白质条带的分 子量之间相差非常大，因此该蛋白质有可能作为要花蜜区别于其他蜂蜜的特征蛋白质。
[0011] 为了得到~17ku蛋白质的分子信息，通过LC-化ip/ESI-QTOF-MS方法进行鉴定。 具体的实现步骤如下： (1) 使用膜蛋白酶将得到的蛋白质胶条进行酶解，然后将酶解后的样品溶于20ml0.1% 甲酸水溶液中，lOOOOr/min离屯、5分钟，取15ml上清液用于LC-Chip/ESI-QTOF-MS分析； (2) 将酶解得到的全部肤段信息在蛋白质数据库中进行检索。结果表明：只有得分在 57分W上时，检索结果才有显著性（P< 0. 05)，而且得分越高，相似度就越高，同种的可信 度就越高。 阳01引本发明获得了一种鉴别要花蜜花源的特征蛋白，通过LC-化ip/ESI-QTOF-MS方法 进行了鉴定，该要花蜜的蛋白质电泳图谱与油菜蜜、洋槐蜜、荆条蜜、锻树蜜、龙眼蜜、构杞 蜜和葵花蜜7种蜂蜜的蛋白质图谱存在显著差异，可W用来作为鉴别要花蜜花源的依据。
【附图说明】
[0013] 图1为不同单花种蜂蜜的电泳图谱； 图2为不同地区要花蜜的电泳图谱； 图3为A.不同地区洋槐蜜的电泳图谱巧.不同地区龙眼蜜的电泳图谱；C.不同地 区油菜蜜的电泳图谱；D.不同地区荆条蜜的电泳图谱；E.不同地区葵花蜜的电泳图谱； F.不同地区构杞蜜的电泳图谱；G.不同地区锻树蜜的电泳图谱； 图4为要花蜜特征蛋白质的肤段得分分布图。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合附图和实施例作进一步的说明。
[0015] 实施例1蜂蜜粗蛋白质的制备 分别称取5g蜂蜜样品，并将其溶于5ml蒸馈水中，混匀，5000g离屯、10分钟，收集上清 液，定容至IOml,置于4°C冰箱中保存备