产生的后代，翻模性状不发生分离，都是翻毛。翻毛基因纯合子和翻毛基因杂合子之间会产生约1:1的翻毛基因纯合子和翻毛基因杂合子，从而使非翻毛基因传代下去。翻毛基因杂合子之间产生的后代，会出现平毛的个体。
[0024]一、SNP多态的发现
在测序时发现一个与翻毛性状显著关联的SNP标记。在E22C19W28_E50C23区域鸡的KRT基因连锁群(genbank序列号AADN03009152.1)第56648位碱基处有一个A56648-G56648的碱基替换，该替换引起SNP多态性。
[0025]二、引物对的设计
在鸡E22C19W28_E50C23 KRT基因连锁群区域设计引物，以基因组DNA为模板，用上述引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，PCR产物直接测序，对测序结果进行比对，对突变位点和翻毛性状进行关联分析并验证，从而得到一对用于检测鸡翻毛A117G突变位点的PCR引物。
[0026]上游引物F:5' -TGATGACCTACGGAACAACC-3' (SEQ IDN0.1)
下游引物 RA' -ATGGCAATGGATGGCTGA -3' (SEQ ID N0.2)。
[0027]上游引物由20个碱基组成，对应E22C19W28_E50C23区域鸡的KRT基因连锁群(genbank序列号AADN03009152.1)第56745-56764 ;下游引物由18个碱基组成，对应AADN03009152.1的56349-56366位碱基序列。引物扩增片段长短416bp。
[0028]
实施例2、修水黄羽乌鸡的翻毛基因PCR扩增和测序 260只修水黄羽乌鸡:购自江西省修水县。
[0029]1、提取基因组DNA 各个样本翅静脉采血，提取高盐法提取基因组DNA。
[0030]具体过程如下:
(I)配置溶液，用于待测鸡的基因组DNA提取
溶液 A:50mM Tris ?Cl (pH 8.0), 5mM EDTA (pH 8.0),20% SDS，室温保存。溶液 B:氯仿:异戊醇(24:1)，遮光保存。
[0031]I)取100 μ I鸡血到L 5 mL离心管 2)加600 μ L溶液A到1.5 mL离心管。
[0032]3)向各个1.5 mL离心管中加10 μ L的ProK (20 mg/mL)，充分混勾。
[0033]4) 55°C水浴消化过夜。
[0034]5)向各个离心管中加入等体积的Tris饱和酚，摇动混匀15min，12000r/min离心1min0
[0035]6)将上层清液取出，装入新的离心管中，重复上述步骤。
[0036]7)取上层清液，加入等体积的酸:溶液B (1:1)混勾lOmin，12000r/min离心1min0
[0037]8)取上层清液加入等体积的溶液B，混匀1min离心12000 r/min，1min0
[0038]9)取上层清液加入2倍体积的冰乙醇(约I mL)再加1/10体积的约60 μ L的NaAc水平摇动，可见絮状的DNA样品出现。
[0039]10)将样品置于-20°C冷冻30 min，取出或挑出DNA或离心，12000r/min，1min,
DNA沉于管底。
[0040]11)用75%乙醇洗涤DNA，摇动洗涤后，离心12000 r/min，5-lOmin。
[0041]12)弃去75%乙醇，自然干燥后，加入适量(约100 μ L)TE溶解。
[0042]13) -20°C 保存(基因组 DNA)。
[0043]2、以基因组DNA为模板，用实施例1设计的弓I物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR反应体系(25 μ I):2.5μ I 1XTaq DNA聚合酶缓冲液(500mmol/L KCl,10mmoI/L Tris.Cl，15mmol/L MgCl2, )，I μ I dNTPs(ATP、TTP、GTP、CTP 的浓度均为2.5mmol/L)，I μ I 引物(0.5 μ M)，0.25 μ I 2.5U/ μ L Taq DNA 聚合酶，60ng 模板。PCR 反应条件:95°C 5min，94°C 30 s，56°C 30s，72°C 30s，33 个循环，72°C lOmin，4°C保存。
[0044]3、将PCR扩增产物测序
PCR产物采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。测序结果表明:AA基因型个体的PCR扩增产物的核苷酸序列图2所示；AG基因型个体的PCR扩增产物的核苷酸序列图3所示；GG基因型个体的PCR扩增产物核苷酸序列图4。
【主权项】
1.鸡翻毛性状相关的分子标记，其特征在于:核苷酸序列如序列表序列I和2所示。2.根据权利要求1所述的鸡翻毛性状相关的分子标记，其特征在于:在序列3所示序列的第117位碱基处有一个A117-G117的碱基替换。3.根据权利要求1所述的鸡翻毛性状相关的分子标记，其特征在于:其中用于检测序列3所示序列的第117位碱基处有一个A117-G117的碱基替换的引物对的DNA序列如下所示: 正向引物:5' -TGATGACCTACGGAACAACC-3'， 反向引物:5' -ATGGCAATGGATGGCTGA -3'。4.权利要求1所述的鸡翻毛性状相关的分子标记的应用，其特征在于:应用于与鸡翻毛相关性状标记辅助选择的关联分析上。5.—种辅助鉴定翻毛鸡中的翻毛基因纯合子(AA)、翻毛基因杂合子(AG)和平毛基因纯合子(GG)的方法: a提取待测鸡的基因组DNA ; b鸡E22C19W28_E50C23KRT基因连锁群区域设计引物； c以基因组DNA为模板，用设计引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，PCR产物直接测序，对测序结果进行比对，对突变位点和翻毛性状进行相关分析验证，从而找到权利要求3中所述引物对； d.根据PCR产物测序鉴定PCR扩增直接测序，测定产物核苷酸序列，从而判断是待测鸡为候选是翻毛基因纯合子，还是翻毛基因杂合子和平毛基因的纯合子。
【专利摘要】本发明公开了一个鸡翻毛性状相关的分子标记及其应用，属于生物技术领域，在E22C19W28_E50C23区域鸡的KRT基因连锁群（genbank序列号AADN03009152.1）第56648位碱基处有一个A56648-G56648的碱基替换，该替换引起SNP多态性，通过采用检测引物在该位点碱基替换情况来作鸡标记辅助选择关联分析，判断鸡翻毛性状。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105219771
【申请号】CN201510756381
【发明人】武艳平, 谢金防, 霍俊宏, 刘林秀, 谢明贵, 康昭风, 季华员
【申请人】江西省农业科学院畜牧兽医研究所
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月10日