Menin因子的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种肿瘤抑制因子Menin的应用。
【背景技术】
[0002] 膜腺癌是目前已知的一种致命性的癌症，严重影响了人类健康。几乎所有的膜腺 癌患者都会面临癌细胞转移，最后因癌细胞的增长无法控制而死亡。因此，了解膜腺癌的发 病机制W及发展预后机制，对于诊断、预防和治疗运种疾病是非常重要的。
[0003] 和其他的恶性肿瘤疾病类似，膜腺癌主要也是由基因的获得性突变的积累引起 的，如癌基因、肿瘤抑制基因及基因组维持基因等的突变。膜腺癌中的单个抑癌因子基因 K-ras、pl6、TP53、MADH4W及BRCA2 的突变率分别为 85%、82%、76%、53%W及 10%。在 膜腺癌的发展过程中，除了基因水平的突变，生长因子、受体、细胞周期调节因子W及表观 遗传因子中的异物，也会影响下游祀基因的激活或抑制，参与祀基因的生长及分化的控制。 运些扰动对于侵入性的W及转移性的表型的发展赋予了极大的优势。
[0004] 近些年，基于表观遗传调控可逆性的观点，改变表观调控模式成为了一个潜在的 治疗途径。大家普遍认同，反常的DNA甲基化的出现是发生癌病变的关键因素。例如，在多 种癌症中，细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK)抑制因子，如p27和pl6在沉默基因时，其启动 子是高度甲基化的。与之前的研究一致，膜腺癌患者中的DNA甲基转移酶1值皿tl)是过表 达的，且受肠高血糖素（Gli)的调控。
[000引编码menin因子的MENl基因的突变，会引起一种名称为多发性内分泌瘤1型的可 遗传的肿瘤综合征，其特征在于，易引起多发性内分泌器官如甲状旁腺、膜岛W及其他非内 分泌器官中癌变因子的发展。Menin因子参与细胞增殖、调亡化及DNA损伤等多种细胞过 程。已有报道表明，膜腺癌神经内分泌肿瘤（Pan肥Ts)中的menin突变率高，同时，menin因 子还调控膜岛W及膜腺多发性肿瘤的生长。另外，menin和也染色质重塑因子，如组蛋白甲 基转移酶（HMT)W及组蛋白去乙酷化酶（HDAC)相互作用，调控目标基因的转录。运些发现 提供了一种Menin因子和膜腺癌相关的肿瘤存在联系的启示。然而，目前对于Menin因子 是否会在占膜腺恶性肿瘤80%的膜腺导管腺肿瘤中不受管制，还无法确定，同时，其在膜腺 癌中的作用也尚未进行过研究。
【发明内容】
[0006] 本发明是为解决上述问题而进行的，对menin因子调节膜腺癌细胞的生长机制进 行探讨，为未来进行膜腺癌的诊断和治疗提供一种参考。
[0007] 本发明的目的之一在于提供一种menin因子在诊断膜腺癌中的应用，诊断产品包 括用实时巧光定量PCR、免疫沉淀反应、微阵列、基因忍片诊断膜腺癌的产品。
[0008] 巧光定量PCR的引物的序列如SEQIDNO. 1W及SEQIDNO. 2所示，免疫沉淀反 应中与Menin蛋白特异性结合的抗体为抗DNA甲基转移酶1 0nmtl)抗体。
[0009] 本发明的另一个发明目的在于提供了一种menin因子在治疗膜腺癌中的应用，治 疗产品包括使得menin因子过表达的成分。
[0010] 发明作用与效果
[0011] 本发明掲示了Menin因子在抑制膜腺癌细胞的生长中的作用，并通过Menin因子 调节祀基因转录，为menin因子诊断或治疗膜腺癌提出了一种新的调控机制。
【附图说明】
[0012] 图1是本发明的Menin因子在膜腺癌发展过程中的表达结果；
[0013] 图2是本发明的Menin因子调控膜腺癌细胞生长的实验结果；
[0014] 图3是本发明的Menin因子调控细胞周期调节因子表达的实验结果；
[0015] 图4是本发明的Menin因子降低pl8W及p27启动子甲基化水平的结果；
[0016] 图5是本发明的Menin因子和D皿tl相互作用的实验结果；
[0017] 图6是本发明的Menin因子和D皿tl相互作用对化dgehog信号路径的实验结果。
【具体实施方式】
[0018]W下结合附图来说明本发明的【具体实施方式】。应理解，运些实施方式仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。
[0019] 下列实施例中，未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件如Sm油rook 等人，分子克隆：实验室手册（New化rk:ColdSpringHarborL油oratoryPress, 1989)中 所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0020] 一、材料与方法
[0021] 1、患者和组织样本
[0022] 样本采集自2010年7月至2012年6月期间接受膜腺癌手术的64名患者。运些 患者中，年龄最小的为35岁，年龄最大的是81岁，平均年龄56岁，共39名男性患者，25名 女性患者。临床分类基于膜腺癌的分类。
[0023] 样本包括膜腺癌肿瘤组织W及癌旁正常组织（2.Ornm),组织样本的大小约为 2.OX1. 5X0. 4cm。样本被分为四组，来进行不同的实验：第一组在Trizol试剂中裂解，用 于RNA提取；第二组为新鲜冰冻组织用于DNA提取；第S组和浓度为10%的多聚甲醒混合， 用于病理鉴定；第四组在2XSDS-PAGE缓冲液中进行westernblot分析。
[0024] 2、细胞培养及试剂
[00巧]肥K293T细胞和膜腺癌细胞株（PANC-1、ASPC-1、MIAPaCa-2、Bxpc-3)从中国科学 院（CAS，上海，中国）的典型培养物保藏的细胞库购买，细胞按照供应商的说明进行培养。 甲基转移酶5-Aza-dC、化dgehog抑制因子环己胺W及化dgehog促进剂SAG均购自于Sigma 公司（圣路易斯，MO,美国）。
[0026] 二、实验方法
[0027]1、RNA提取和实时巧光定量PCR分析
[0028] 使用TRIzol试剂（Invitrogen，美国）按照供应商的说明从组织或细胞的中提取 总RNA。反转录使用TakaraRNAPCR试剂盒（Takara，大连，中国），按照制造商的说明进 行，具体步骤如下：
[002引 （I)RNA的抽提
[0030] 步骤1，收集细胞，加入Iml的TRIzol试剂裂解，然后加入0. 2ml的氯仿，盖紧管 盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30°C解育2到3分钟。4°C下1200化pm离屯、15分钟。 离屯、后混合液体将分为下层的红色酪氯仿相，中间层W及无色水相上层。RNA全部被分配于 水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIzol试剂的60%。
[0031] 步骤2,RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离屯、管中。加等体积异丙醇 混合W沉淀其中的RNA，混匀后15到30°C解育10分钟后，于4°C下1200化pm离屯、10分钟。 此时离屯、前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
[0032] 步骤3,RNA清洗移去上清液，每ImlTRIzol试剂裂解的样品中加入至少Iml的 75 %乙醇（75 %乙醇用DEPC肥0配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4°C下7000巧m离屯、5分钟。
[0033] 步骤4,RNA干燥小屯、吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空气中干燥5-10分 钟。
[0034] 步骤5,溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40y1用枪反复吹打几次， 使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80°C待用。
[0035] (2)巧光定量PCR(Q-PCR)
[003引步骤1，反转录合成CDNA:采用01igodT引物和1yg总RNA进行CDNA的合成；
[0037] 步骤2,配置实时定量PCR反应体系：SYBR Green1染料10y L;上游引物1 y L ; 下游引物1 y L ;dNTP 1 y L ;Taq聚合酶2 y L ;cDNA 5 y L
[0038] 步骤3,将配制好的PCR反应溶液置于Real time PCR仪上进行PCR扩增反应。反 应条件为：93°C 2分钟预变性，然后按93°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C 1分钟，共40做个循 环，最后72°C 7分钟延伸。
[0039] 为了定量目的基因的转录，在AB口900仪（ABI，CA,USA)上使用SYBRGreen预混 物ExTaqCTakara公司）进行实时PCR。根据PCR记录，绘制烙融曲线，采用3憐酸甘油醒 脱氨酶（3-GAPDH)的归一化对目标mRNA的相对含量进行说明。PCR过程中，MeninW及在 考察Menin因子和膜腺癌关系中所设及的其他基因扩增引物的序列如表1所示：
[0040] 表1menin因子及相关基因扩增的引物序列表
[0041]
[0043] 2、Weston Blot分析
[0044] 步骤如下：
[0045] 步骤1，细胞在放射免疫沉淀巧IPA)缓冲液中进行裂解，缓冲液含有50mmol/L、抑 为 7. 4 的Tris-盐酸，150mmol/L的化Cl, 1 %NP40 和 0. 1 %SDS，或者直接在 2*SDS-PAGE 缓冲液中裂解。
[0046] 步骤2,在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100°C水 浴加热3-5分钟，W充分变性蛋白。
[0047] 步骤3,冷却到室溫后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶的加样孔内。
[004引步骤4,电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5minX3次。转膜装 置从下至上依次按阳极碳板、滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、 凝胶、硝酸纤维素膜精确对齐，每一步去除气泡，接通电源，恒流转移1.