癌细胞生长的下游目标，采用微阵列对对照组W及 Menin过表达MIAPaCa-2细胞之间的基因表达模式进行比较。总共比较了 721个基因，其中， 316个基因表达上升，405个基因表达下调，如图3A所示，CDK抑制因子p27和pl8显示出 了极高的表达水平上升，而CDK2和CDK4则显示出了明显的表达水平下降，运和MIAPaCa-2 细胞中的Menin过表达的抑制效应明显一致。除此之外，H0XA9W及表观遗传因子HDM：5、 CBX4的表达也减少，其他基因如ESMUIGFBP7、和Hedgehog/Gli的信号祀标GASl的表达也 由于Menin过表达而显著减少。另外，Menin过表达MIAPaCa-2细胞对上述基因解除调控 也被Q-PCR的结果所证实，见图3B。
[0099] 为了进一步证实运些结果，对Menin被抑制细胞中的可能成为Menin祀标的基因 的表达进行测定，结果如图3C所示，由于Menin因子的消耗，Menin过表达细胞中的上调基 因pl8、p27、H0XA9、HDAC5W及CBX4的表达被抑制；而Menin被抑制的ASPC-I细胞中的下 调基因CDK2、CDK4、ESM1、IGFBP7W及GASl的表达被极大催生。运些发现证实，Menin可能 通过调控重要的细胞周期调控因子的表达来抑制膜腺癌细胞的生长。
[0100] Menin下调pl8W及p27启动子的甲基化水平
[010。 利用膜腺癌患者样本中的cDNA，对I-IV期膜腺癌组织W及与其临近的正常组织 中的pl8和p27的相对表达水平进行测定。如图4A所示，和Menin的表达模式类似，随着 膜腺细胞癌变的发展，Pl8和p27的表达也呈下调趋势。
[0102] 尽管之前已有Menin通过促进pl8和p27组蛋白甲基化来调控膜岛细胞的生长报 道，但运对于理解Menin是否能够影响DNA甲基化运一导致细胞周期因子发生崎变而不受 约束的调控路径于事无补。申请人首先采用MSP对膜腺癌组织W及与其临近的正常组织中 的pl8和p27启动子的甲基化水平进行测定。和预计中的结果类似，膜腺癌组织中的pl8和 p27启动子的甲基化水平显著上调（图4B所示），运和图4A中的两种基因的表达水平下降 一致。接着，在MIAPaCa-2细胞中对依赖于Menin过表达的甲基化水平进行测定。如图4C 所示，由于Menin过表达，pl8和p27启动子的甲基化水平显著下降，导致了图3B中的pl8 和p27的转录激活。并且，Menin过表达的MIAPaCa-2细胞甲基化状态的改变也被图4D中 的DIP分析结果证实。因此，Menin能够通过抑制pl8W及p27基因启动子的DNA甲基化 来促进Pl8W及p27的转录激活。
[010引Menin和D皿tl相互作用来减弱D皿tl富集W及随后的pl8W及p27基因启动子 的DNA甲基化状态
[0104] Menin和染色质重塑因子如HMT和HDAC结合调控目标基因的转录。假设Menin和 DNA甲基转移酶结合去调控pl8W及p27基因启动子的DNA甲基化状态。尽管已有报道说 明在膜腺癌前期W及膜腺导管癌中，Dnmt1表达水平增加，但Dnmt1在膜腺癌中的作用尚未 阐明。
[0105] 检测膜腺癌组织W及与其临近的正常组织中的D皿tl的转录水平。如图5A所 示，相对于正常组织，Dnmtl在膜腺癌组织中过表达。接着，通过有效损耗ASPC-I细胞中的 D皿tl来测定D皿tl的作用（图5B)，如图5C所示，D皿tl表达受抑制导致了ASPC-I的细 胞生长受抑制，运个menin过表达的结果相类似。同时，如图抓所示，在Dnmtl受抑制的细 胞中，pl8W及p27的表达也显著下调。
[0106]W上结果表明，Dnmtl受抑制将减缓pl8W及p27的转录受抑制的程度。为了进一 步确认，发明人采用一种名称为5-Aza-dC的Dnmtl抑制因子强制抑制ASPC-I细胞启动子 的甲基化，如图祀所示，发现Pl8和p27被5-Aza-dC强烈诱导，并和其剂量呈正相关。图 5F为免疫共沉淀的结果，如图5F所示，D皿tl和menin之间显示了一种明显的相互作用，运 种作用也被ASPC-I细胞证实在细胞内也存在，结果如图5G所示。
[0107] 图甜显示了化IP的分析结果，目的是为了确定menin是否能够减弱Dnmtl在目 标基因pl8/p27启动子上的富集，WMIAPaCa-2细胞中的抗D皿tl抗体进行检测。结果显 示，Dnmtl在目标基因pl8/p27启动子上的富集明显下降，而Dnmtl和对照组GAPDH启动子 的结合活性并未出现明显变化。
[0108]W上数据证明了Menin通过和D皿tl竞争性结合来降低pl8/p27启动子的DNA甲 基化水平。
[0109]Menin和D皿tl相互作用在化dgehog信号路径下游扮演的角色
[0110] 如图6A所示，和图3中的微阵列的分析结果一致，由于menin过表达，Glil和Gasl 的表达被明显抑制。为了确定化imtl-menin复合是否受化dgehog信号路径调控，发明人利 用lOymol/L环己胺去阻塞化dgehog信号。如图她所示，在用环己胺作用MIAPaCa-2细 胞48小时后，Glil和D皿tl表达下降，而Menin的表达水平却显著上调。该结果也被图6C 所示的westernblot的分析结果所证实。相反，当MIAPaCa-2细胞被化dgehog激动剂SAG 作用激活化dgehog信号时，如图抓所示，Glil和Dnmtl的表达被显著引导而Menin的表 达被抑制。
[01U] D皿tl能够和肺腺癌基因的menin因子的中屯、结合，发明人假定，当化dgehog信号 路径取决于Dnmtl表达上调时，menin或许不会被激活。为了证实运一假设，将激动剂SAG作用于D皿tlshRNA2表达细胞48小时，如图6E所示，由于D皿tl受抑制，menin表达受抑 制的现象减弱，说明menin在化dgehog信号路径下游的表达是否受抑制取决于Dnmtl是否 被激活。
[0112] 由于menin是化dgehog信号的负相关因子，其过表达可W中和化dgehog信号对 膜腺癌细胞生长所起的作用。因此，当对照或menin过表达的MIAPaCa-2细胞分别被SAG处 理24、48及72小时后，如图6F所示，尽管化dgehog信号被SAG激活可强烈促进膜腺癌细 胞的生长，但SAG的运种促进作用会被menin的过表达明显隐藏。换句话说，menin过表达 能够绕过化dgehog信号去抑制膜腺癌细胞的生长。在menin过表达的细胞中，SAG对p27 和pl8表达的抑制作用也被减小。但p27和pl8在menin过表达的细胞中的表达水平比对 照组高，不管细胞是否被SAG处理过。有意思的是，D皿tl的表达水平不受menin过表达的 影响，结果见图6G。
[0113] 综上，menin过表达和D皿tl竞争性相互作用去减弱p27和pl8启动子的甲基化 水平，随后导致p27和pl8的转录激活进而抑制膜腺癌细胞生长。
[0114] 实施例作用与效果
[0115] 本实施例对menin因子过表达抑制膜腺癌细胞生长的机理进行了阐述，menin因 子一方面通过上调基因pl8、p27、H0XA9、HDM：5W及CBX4的表达W及抑制下调基因CDK2、 CDK4、ESMl、IGFBP7、GASl的表达来抑制膜腺癌细胞的生长；另一方面Menin通过和IMmtl 竞争性结合来降低pl8/p27启动子的DNA甲基化水平，来促进pl8/p27基因的转录来抑制 膜腺癌细胞的生长，为膜腺癌的治疗提出了一种新的途径。
[0116]
【主权项】
1. 一种Menin因子的应用，其特征在于： 所述Menin因子在制备诊断胰腺癌的产品中的应用。2. 根据权利要求1所述的Menin因子的应用，其特征在于： 其中，所述诊断胰腺癌的产品为用荧光定量PCR或免疫沉淀反应来诊断胰腺癌的产 品。3. 根据权利要求2所述的Menin因子的应用，其特征在于： 其中，所述用荧光定量PCR诊断胰腺癌的产品中至少包含一对特异扩增Menin基因的 引物，所述引物的序列如SEQIDNO. 1以及SEQIDNO. 2所示。4. 根据权利要求2所述的Menin因子的应用，其特征在于： 其中，所述用免疫沉淀反应诊断胰腺癌的产品中至少包含与Menin蛋白特异性结合的 抗体。5. 根据权利要求4所述的Menin因子的应用，其特征在于： 其中，所述抗体为抗DNA甲基转移酶1抗体。6. -种Menin因子的应用，其特征在于： 所述Menin因子在制备治疗胰腺癌的药物或试剂中的应用。7. 根据权利要求6所述的Menin因子的应用，其特征在于： 其中，所述药物或试剂中包含促进所述Menin因子过表达的物质。
【专利摘要】本发明提供了肿瘤抑制因子menin在诊断和治疗胰腺癌中的应用，对menin因子过表达抑制胰腺癌细胞生长的机理进行了阐述，menin因子一方面通过上调基因p18、p27、HOXA9、HDAC5以及CBX4的表达以及抑制下调基因CDK2、CDK4、ESM1、IGFBP7、GAS1的表达来抑制胰腺癌细胞的生长；另一方面Menin通过和Dnmt1竞争性结合来降低p18/p27启动子的DNA甲基化水平，来促进p18/p27基因的转录来抑制胰腺癌细胞的生长，为胰腺癌的治疗提出了一种新的途径。
【IPC分类】G01N33/574, A61K38/17, C12Q1/68, A61P35/00
【公开号】CN105219859
【申请号】CN201510672222
【发明人】程鹏, 金钢, 张怡杰, 李刚, 王云峰, 陈颖, 郝骏, 刘彻, 李森
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月16日