一种条斑紫菜抗菌肽的纯化方法及其氨基酸序列的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明设及一种利用条斑紫菜水溶性蛋白质，经过蛋白质酶解、纯化和序列分析， 获得条斑紫菜抗菌肤并明确其氨基酸序列。
【背景技术】：
[0002] 紫菜（Po巧hyra)属红藻口烟lodophyta)红毛菜科度angiacea)，广泛分布于从寒 带到亚热带的潮间带水域。条斑紫菜（Por地yrayezoensis)是我国重要的经济海藻之一， 其蛋白质含量高达36. 31%，雄踞海藻之首。研究表明，由特定酶降解蛋白质已明确成为生 物活性肤的良好来源。因此，条斑紫菜蛋白质可望成为活性肤的重要来源，具有潜在的应用 前景。
[0003] 随着致病菌抗药性问题日益突出，寻找全新类型的抗生素是解决抗药性问题的一 条有效途径。由于海洋生物资源的特殊性，人们对从海洋生物中开发更多新的抗菌特效药 物，寄予了极大的希望。
[0004] 本发明着眼于W条斑紫菜为原料，经蛋白质提取、纯化、酶解再纯化制备一种对金 黄色葡萄球菌有抑制作用的多肤，并测定其氨基酸序列，为条斑紫菜和坛紫菜的高值化利 用提供新方法。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的在于提供一种W条斑紫菜为原料制备一种新型抗菌肤的方法，并就 其氨基酸序列进行测定。
[0006] 为了实现上述目的，本发明的主体工艺包括条斑紫菜水溶性蛋白质初步纯化、酶 解、分级、纯化及序列分析等步骤，其中
[0007] 条斑紫菜水溶性蛋白质的初步纯化：先将条斑紫菜水溶性蛋白质溶液W30%饱 和度硫酸锭沉淀，离屯、去除沉淀，上清液硫酸锭饱和度调至50%，离屯、，将沉淀经透析除盐， 制成水溶性蛋白质II冻干粉。
[000引水溶性蛋白质II的酶解与分子量分级：将水溶性蛋白质IIW胃蛋白酶降解，胃蛋 白酶使用量为底物蛋白质质量的1/1000,介质抑1. 5,在40°C酶解2小时。将酶解液超滤， 保留分子量< 5KD级分并冻干保存。 阳009] 抗菌肤纯化：取分子量< 5邸级分适量，上Se地adexG-25层析柱，蒸馈水洗脱，控 制流速0. 7血/min,每4分钟收集1管，洗脱结束后，分别在220皿和280皿下比色得洗脱曲 线（图1)，活性测定后将峰2冻干得肤样品A。取A适量上Se地adexC-25层析柱，分别在 220nm和280nm下比色得到洗脱曲线（图2)，经活性测定得知峰2具强抑菌活性，冻干得肤 样品B备用；
[0010] 抗菌肤序列分析：对肤样品B进行混合质谱测序数据采集和数据分析，确定肤段 氨基酸序列为：TPDSEAL分子量：732,等电点（pi) :9. 59.该抗菌肤质谱图见图3.
[0011] 本发明纯化过程简便，所得抗菌肤产品纯度高。
【附图说明】
[0012] 图1是Se地adexG-25层析洗脱曲线
[0013] 图2是Se地adexC-25层析洗脱曲线
[0014] 图3是抗菌肤质谱图
【具体实施方式】：
[0015] 下面通过实例对本发明作进一步阐述：
[0016] 先将条斑紫菜水溶性蛋白质溶液（含蛋白质100. 0克）W30 %饱和度硫酸锭沉 淀，离屯、去除沉淀，上清液硫酸锭饱和度调至50%，离屯、，将沉淀经透析除盐，制成水溶性蛋 白质II冻干粉21. 1克；取10克W蒸馈水溶解后W胃蛋白酶降解，胃蛋白酶使用量为底物 蛋白质质量的1/1000,调节介质抑1. 5,在40°C酶解2小时，将酶解液超滤分级得分子量 < 5邸级分冻干粉2. 2克；取分子量< 5邸级分适量，上Se地adexG-25层析柱，蒸馈水洗 脱，控制流速0. 7血/min,每4分钟收集1管，洗脱结束后，分别在220皿和280皿下比色得 洗脱曲线（图1)，将峰2冻干得肤样品A;取A适量上Se地adexC-25层析柱，分别在220皿 和280nm下比色得到洗脱曲线（图2)，将峰2冻干得肤样品B备用；对肤样品B进行混合质 谱测序数据采集和数据分析，确定肤段氨基酸序列为：TPDSEAL分子量：732,等电点（pi): 9. 59〇
【主权项】
1. 一种条斑紫菜抗菌肽的纯化方法及其氨基酸序列，包括如下步骤： 条斑紫菜水溶性蛋白质的初步纯化：先将条斑紫菜水溶性蛋白质溶液以30%饱和度 硫酸铵沉淀，离心去除沉淀，上清液硫酸铵饱和度调至50%，再离心，将沉淀经透析除盐，制 成水溶性蛋白质II冻干粉； 水溶性蛋白质II的酶解与分子量分级：将水溶性蛋白质II以适量蒸馏水溶解后以胃 蛋白酶降解，胃蛋白酶使用量为水溶性蛋白质II质量的1/1000,介质PHI. 5,在40°C酶解2 小时，将酶解液超滤，保留分子量< 5KD级分并冻干保存； 抗菌肽纯化：取分子量<5KD级分适量以蒸馏水溶解后上S印hadexG-25层析柱，蒸馏 水洗脱，控制流速0. 7mL/min，每4分钟收集1管，洗脱结束后，分别在220nm和280nm下比 色得洗脱曲线，将峰2冻干得肽样品A;取A适量上S印hadexC-25层析柱，分别在220nm和 280nm下比色得到洗脱曲线，将峰2冻干得肽样品B; 抗菌肽序列分析：对肽样品B进行混合质谱测序数据采集和数据分析，确定肽段氨基 酸序列为：TTOSEAL。
【专利摘要】本发明公开了一种条斑紫菜抗菌肽的纯化方法，该方法包括条斑紫菜水溶性蛋白质的初步纯化、水溶性蛋白质II的酶解与分子量分级、抗菌肽纯化及抗菌肽序列分析等步骤。本发明对条斑紫菜中水溶性蛋白质经过饱和度为30～50％硫酸铵盐析分级获得水溶性蛋白质II，再经胃蛋白酶降解、超滤分级获得分子量＜5KD级分，先上Sephadex？G-25层析柱，蒸馏水洗脱，洗脱曲线峰2组分上Sephadex？C-25层析柱继续纯化，洗脱曲线峰2组分冻干即得抗菌肽TPDSEAL，该抗菌肽对金黄色葡萄球菌具有强抑制作用。本发明纯化方法简便快捷，可用于以我国资源丰富的条斑紫菜为原料制备抗菌肽，对条斑紫菜的高值化利用具有重要意义。
【IPC分类】C12P21/06, C07K7/06, C07K1/16
【公开号】CN105255977
【申请号】CN201510448341
【发明人】魏玉西, 于佳, 徐传金, 于春燕, 宋惠平, 王文秀
【申请人】青岛大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年7月24日