隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种检测试剂盒，特别是设及一种基于免疫磁分离技术的隐抱子虫和 贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒。
【背景技术】
[0002] 污水再生利用是解决水资源短缺的有效途径，而预防病原性污染和保障水质安全 是其重要前提。隐抱子虫是介水传播的寄生性原虫，主要导致人畜共患的隐抱子虫病。隐 抱子虫病呈世界性分布，迄今已经有6大洲80多个国家至少300多个地区发现了隐抱子虫 病，美国、英国、新西兰等发达国家W及中国、非洲等发展中国家都相继报道了隐抱子虫病 的病例。1993年美国威斯康辛州密尔沃基市40. 3万人因感染隐抱子虫而患病，经调查确认 为市政供水系统被隐抱子虫污染所致。我国于1987年在南京市首次发现了隐抱子虫病例， 随后在徐州、安徽、内蒙古、福建、山东和湖南等省市均报道发现病例。流行病学调查发现， 青海、云南等地的发病率最高。
[0003] 美国国家环保总局扣SEPA)于1999年2月制定并发布的1623方法是国际上最为 常用的两虫（隐抱子虫和贾第鞭毛虫）标准检测方法，它包括浓缩、分离和鉴定Ξ个步骤， 即通过滤筒过滤、免疫磁性分离（IM巧和免疫巧光（IFA)显微镜检测和计数，并借助DAPI 染色和微分干设值1C)显微镜检观察其内部的特征结构来证实卵囊和抱囊的存在。IMS是 指用标记有与卵囊和抱囊表面抗原特异结合的抗体的磁珠与卵囊和抱囊相结合，形成的复 合体被磁珠收集器吸附在样品管壁上，杂质随上清液被去除，从而实现与杂质的分离，是保 证检测过程特异性的关键步骤。目前，在检测过程中作为阳性对照的质控主要为灭活的隐 抱子虫，保质期短（3个月），且成本较高。平均每个样品的检测费用在1500左右。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种成本低，保质期长的基于免疫磁 分离技术的隐抱子虫和贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒。 阳0化]本发明的技术方案概述如下：
[0006] 一种隐抱子虫和贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒，包括隐抱子虫阳性质控和贾第鞭 毛虫阳性质控、抗隐抱子虫多克隆抗体免疫磁颗粒和抗贾第鞭毛虫多克隆抗体免疫磁颗 粒，所述隐抱子虫阳性质控和贾第鞭毛虫阳性质控是由粒径为4-6μπι的量子点标记聚苯 乙締巧光微球包被有隐抱子虫特异性表面蛋白和粒径为6-10μπι的量子点标记聚苯乙締 巧光微球包被有贾第鞭毛虫特异性表面蛋白组成。
[0007] 隐抱子虫特异性表面蛋白优选为Cowp，Cp41或Cd挑，所述Cowp的氨基酸序列是 SEQI化NO. 1所示；所述Cp41的氨基酸序列是SEQI化NO. 3所示，所述Cd挑的氨基酸序列 是沈QID.NO. 2所示。
[0008] 贾第鞭毛虫特异性表面蛋白优选为VSP或G3,所述VSP的氨基酸序列是SEQ I化NO. 4所示，G3的氨基酸序列是SEQI化NO. 5所示。
[0009] 本发明的优点：
[0010] 实验证明，本发明的隐抱子虫和贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒检测样品中的隐抱 子虫和贾第鞭毛虫阳性质控成本低，保质期长，能够有效控制检测成本，促进"两虫"检测的 开展。现有技术的"基于原虫卵囊的阳性质控"成本高，每支1500元，而本申请的用隐抱子 虫和贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒进行检测，成本低，每个水样需150元。
【附图说明】
[0011] 图1为实施例9的试剂盒捕获回的阳性质控。
[0012] 图2为实施例9的试剂盒捕获回的基于原虫卵囊的阳性质控。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，本发明的实施例是为了使本领域 的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
[0014] 选择隐抱子虫和贾第鞭毛虫特异性表面蛋白，将其包被于与其对应大小（隐抱子 虫4-6μm，贾第鞭毛虫6-10μm)量子点标记的聚苯乙締微球，所制备出的微球表面"两虫" 对应的特异性表面蛋白，可W作为具有"两虫"特异性功能的质控，替代"两虫"原虫作为阳 性质控。制备出相应蛋白的多克隆抗体，进而制备出对应的抗"两虫"多克隆抗体免疫磁颗 粒，即可进行检测。 阳〇1引实施例1
[0016] 从NCBI数据库中分别检索隐抱子虫和贾第鞭毛虫特异性表面蛋白，并对获得的 隐抱子虫和贾第鞭毛虫特异性表面蛋白的氨基酸序列通过bias化软件进行同源性比对， 同源性比对相似性较高的作为实验的考虑对象。我们从隐抱子虫的表面蛋白中选取了同源 性较高的Ξ个蛋白，名称分别为Cowp(其氨基酸序列是SEQ1化NO. 1所示），Cp41 (其氨基 酸序列是SEQ1化NO. 3所示）和Cd挑（其氨基酸序列是SEQ1化NO. 2所示），贾第鞭毛虫表 面蛋白中选取了同源性较高的两个蛋白，名称分别为VSP(其氨基酸序列是SEQ1化NO. 4所 示），G3 (其氨基酸序列是SEQ1化NO. 5所示）。
阳0巧实施例2
[0023] 隐抱子虫特异性表面蛋白Cowp的获得及粒径为4-6μm的量子点标记聚苯乙締巧 光微球包被有隐抱子虫特异性表面蛋白Cowp的获得：
[0024] 针对Cowp的基因序列，我们设计的引物为： 阳0巧]Cowp-F:GCGGAATTCTAAATGTTTACATTTTCAGGGAAGCAG(SEQID.NO. 6)
[0026] Cowp-R:GCGCTCGAGTAACCTTGCAGTGTAAAATTTGGGG(SEQ ID. NO. 7)
[0027] 首先利用PCR技术进行基因扩增，并用OMEGA胶回收试剂盒进行PCR产物回收。 将扩增的Cowp目的片段与PMD18-T载体进行连接，生成克隆质粒pMD18-T-Cowp，并进行鉴 定。后进行Cowp目的片段与表达载体pTIG-Trx连接。
[0028] 方法是首先提取克隆质粒pMD18-T-Cowp阳性菌株的质粒，利用EcoRI和化0I 双酶切Cowp基因片段，将酶切出的目的基因进行胶回收，提取；然后提取pTIG-Trx菌株 的质粒，利用EcoRI和化0I双酶切pTIG-Trx基因片段并进行胶回收，最后将Cowp基因 片段与表达载体pTIG-Trx进行连接，完成表达质粒pTIG-Trx-Cowp的构建，并通过培养扩 增，筛选阳性克隆。通过W上步骤获得了Cowp蛋白克隆质粒。将Cowp蛋白克隆质粒诱导 表达，制备大量Cowp蛋白。
[0029] 将Cowp蛋白与粒径为4-6μπι的量子点标记聚苯乙締巧光微球偶联，得到粒径为 4-6μπι的量子点标记聚苯乙締巧光微球包被有隐抱子虫特异性表面蛋白Cowp。
[0030] 实施例3
[0031] 隐抱子虫特异性表面蛋白Cp41的获得及粒径为4-6μm的量子点标记聚苯乙締巧 光微球包被有隐抱子虫特异性表面蛋白Cp41的获得： 阳0巧针对Cp41的基因序列，我们设计的引物为：
[0033] Cp41-F:TGGTGTTGCTTTTACTGCTATTCA(SEQ ID. NO. 8) 阳的4] Cp41-R:AGTAGCAACAGTAGTAACAGTGG(SEQID.NO. 9)
[0035] 其他操作同实施例2,得到大量Cp41蛋白。
[0036] 将Cp41蛋白与粒径为4-6μπι的量子点标记聚苯乙締巧光微球偶联，得到粒径为 4-6μm的量子点标记聚苯乙締巧光微球包被有隐抱子虫特异性表面蛋白Cp41。
[0037] 实施例4隐抱子虫特异性表面蛋白Cd挑的获得及粒径为4-6μm的量子点标记聚 苯乙締巧光微球包被有隐抱子虫特异性表面蛋白Cd挑的获得：
[0038] 针对Cd挑的基因序列，我们设计的引物为：
[0039]Cd挑-F:TCCACGCTTGGTCTCAATTC(沈QID.NO. 10)
[0040] Cdg6-R:CCTTGGTTTGCAGTTGGACG(SEQ ID. NO. 11)
[0041]其他操作同实施例2，得到大量Cd挑蛋白。
[00创将Cd挑蛋白与粒径为4-6μπι的量子点标记聚苯乙締巧光微球偶联，得到粒径为 4-6μπι的量子点标记聚苯乙締巧光微球包被有隐抱子虫特异性表面蛋白Cd挑。
[0043]实施例5贾第鞭毛虫特异性表面蛋白G3的获得及粒径为6-10μm的量子点标记 聚苯乙締巧光微球包被有