一种利用米曲霉发酵罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用米曲霉发酵罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的方法，具体涉及一种抗氧化效果显著的罗非鱼鱼皮抗氧化活性肽的制备方法，属于食品加工技术领域。
【背景技术】
[0002]现有研究表明，鱼皮的蛋白质含量比鱼体的其他部位高，且鱼皮中胶原含量最高可占其蛋白质总量的80%以上。尤其是罗非鱼皮，其蛋白质含量达23%，仅次于草鱼皮(29.80%)，约占其干重的88.5%ο所以罗非鱼皮是一种很好的胶原蛋白原料。而从前人的研究情况看，胶原蛋白酶解产物中至少包括了抗菌肽、ACE抑制肽、抗氧化肽等。这些特性使胶原蛋白及其水解产物在医疗、保健及美容方面具有良好的应用前景，同时也为从罗非鱼皮鱼皮胶原蛋白酶解液中制备抗氧化肽奠定了基础。针对此现象，中国专利CN101225104开发了罗非鱼鱼皮小分子肽螯合锌盐的制备方法，但没有涉及到抗氧化活性肽的制备方法，更没有涉及到发酵法制备罗非鱼鱼皮抗氧化活性肽的方法。因此，目前发酵法制备罗非鱼鱼皮抗氧化活性肽的研究是一个新的领域。
[0003]微生物发酵法是以底物蛋白作为发酵培养基的组成成分之一，选择优良的发酵菌种，利用微生物在生长过程中产生的蛋白酶水解底物蛋白制备生物活性肽。微生物发酵法制备生物活性肽具有有机溶剂使用量少、高效等特点。
[0004]本专利选择罗非鱼鱼皮为原料，针对目前罗非鱼加工业中加工利用率低，产品形式单一，精深加工及研究少等现状，运用生物发酵技术制备具有抗氧化活性的多肽。不仅能够回收利用鱼皮中的胶原蛋白，扩大胶原蛋白和抗氧化肽的资源，拓宽胶原蛋白的应用范围，实现罗非鱼皮等加工下脚料的洁净(环保型)利用，丰富产品结构，提高我国水产养殖业的可持续发展能力，增强在国际市场的竞争力，缩短与发达国家在海洋生物资源综合利用技术和理论上的差距有重大意义；同时还能填补发酵法制备罗非鱼皮抗氧化肽的相关空白，为抗氧化类产品的研发和作为功能性食品、药品及化妆品辅料和功能因子积累有效的参考数据，具有重大的经济价值和良好的社会效益。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有技术存在的不足，提供一种利用米曲霉发酵罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的方法，能充分满足市场上对抗氧化活性肽的需求，最大限度的为人类提供健康的食品原料，并在此基础上实现罗非鱼加工下脚料一鱼皮的高值化利用。
[0006]为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是:
一种利用米曲霉发酵罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的方法，包括如下步骤:
(1)预处理:清洗后的罗非鱼鱼皮经脱脂后，依次用0.1-0.13mol/L的盐酸溶液和0.l-ο.12mol/L的氢氧化钠溶液浸泡1_2小时；
(2)水提:预处理后的鱼皮经洗涤至中性后，在45-50°C条件下，用1-2倍体积的蒸馏水恒温匀浆8-10小时后，抽滤提取上清液； (3)灭菌:提取的上清液在121°C条件下灭菌20分钟，然后冷却备用；
(4)米曲霉发酵:种子液添加量为1_8%，在温度为28-31°C，pH为6-8条件下发酵50-80小时；
(5)离心超滤:将上述发酵液于5000r/min离心20min后取上清液，于0.18MPa、40°C下采用分子量为lOkDa的超滤膜进行处理，得到超滤液；
(6)冷冻干燥:将超滤液于-40?_50°C，真空度0~20Pa下进行冷冻干燥，即得到抗氧化活性肽产品。
[0007]本发明的显著优点是:
(1)通过生物发酵法制备罗非鱼鱼皮抗氧化活性肽；
(2)本发明制备的罗非鱼鱼皮抗氧化活性肽抗氧化效果显著，其DPPH自由基和羟自由基的IC50值分别为1.09 mg/mL和L 21mg/mL，是一种极具潜力的生物活性肽原料；
(3)生物活性肽由于其安全、易吸收、成本低等特点，具有良好的市场前景。本发明采用酶法水解米渣蛋白制备抗氧化活性肽，不仅原料成本低廉，而且所得到的活性肽具有氨基酸组成合理、低过敏性、安全可靠等特点，特别是具有较强的抗氧化性，是极具潜力的一种功能性食品基料；
(4)本发明是以罗非鱼加工下脚料一鱼皮为原料，提供一种利用米曲霉发酵罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的方法，大大提高了罗非鱼下脚料的附加值，且生产成本低，工艺简便，绿色环保，实现了罗非鱼下脚料的高值化利用，具有很好的应用价值。
【具体实施方式】
[0008]下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
[0009]实施例1
一种利用米曲霉发酵罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的方法，包括如下步骤:
(1)预处理:清洗后的罗非鱼鱼皮经脱脂后，依次用0.13mol/L的盐酸溶液和0.lmol/L的氢氧化钠溶液浸泡1小时；
(2)水提:预处理后的鱼皮经洗涤至中性后，在50°C条件下，用1倍体积的蒸馏水恒温匀浆8小时后，抽滤提取上清液；
(3)灭菌:提取的上清液在121°C条件下灭菌20分钟，然后冷却备用；
(4)米曲霉发酵:种子液添加量为1%，在温度为28°C，pH为6条件下发酵50小时；
(5)离心超滤:将上述发酵液于5000r/min离心20min后取上清液，于0.18MPa、40°C下采用分子量为lOkDa的超滤膜进行处理，得到超滤液；
(6)冷冻干燥:将超滤液于_40°C，真空度20Pa下进行冷冻干燥，即得到抗氧化活性肽
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[0010]实施例2
一种利用米曲霉发酵罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的方法，包括如下步骤:
(1)预处理:清洗后的罗非鱼鱼皮经脱脂后，依次用0.13mol/L的盐酸溶液和0.lmol/L的氢氧化钠溶液浸泡1小时；
(2)水提:预处理后的鱼皮经洗涤至中性后，在50°C条件下，用2倍体积的蒸馏水恒温匀浆10小时后，抽滤提取上清液；
(3)灭菌:提取的上清液在121°C条件下灭菌20分钟，然后冷却备用；
(4)米曲霉发酵:种子液添加量为8%，在温度为31°C，pH为8条件下发酵80小时；
(5)离心超滤:将上述发酵液于5000r/min离心20min后取上清液，于0.18MPa、40°C下采用分子量为lOkDa的超滤膜进行处理，得到超滤液；
(6)冷冻干燥:将超滤液于_50°C，真空度5Pa下进行冷冻干燥，即得到抗氧化活性肽产品Ο
[0011]实施例3
称取900.8g冲洗干净的罗非鱼鱼皮，脱脂处理后依次用700ml的0.llmol/L的盐酸溶液和0.llmol/L的氢氧化钠溶液浸泡2小时，蒸馏水洗涤至中性后，在48°C条件下，用1500ml的蒸馏水恒温匀浆10小时，抽滤提取得到上清液；
灭菌:提取的上清液在121°C条件下灭菌20分钟，然后冷却备用；
米曲霉发酵:种子液添加量为5%，在温度为28°C，pH为7条件下发酵70小时；
离心超滤:将上述发酵液于5000 r/min离心20min后取上清液，于0.18MPa、40°C下采用分子量为lOkDa的超滤膜进行处理，得到超滤液；
冷冻干燥:将超滤液于_45°C，真空度10Pa下进行冷冻干燥，即得到抗氧化活性肽产品Ο
[0012]DPPH自由基清除活性的测定:清除稳定的DPPH自由基的能力已被广泛用来测试各种抗氧化物的抗氧化能力。不同浓度的罗非鱼鱼皮发酵产物的DPPH自由基清除能力随着浓度的增加而增长。经计算，当发酵产物的浓度达到7.7mg/mL时其DPPH自由基清除率可达99.91%，表现出与Vc相似的自由基清除能力。
[0013]用IC50值(清除率为50%时的抗氧化剂浓度)来评估清除能力，IC50值越低表示自由基清除能力越高。罗非鱼鱼皮发酵产物的IC50值为1.09mg/mL。
[0014]羟自由基清除活性测定:细胞中发生的许多生化反应均与羟自由基有关，它可导致DNA断裂、突变、脂质氧化、蛋白质变性等多种病理性变化，羟自由基是已知的最强氧化剂。罗非鱼鱼皮发酵产物的羟自由基清除能力随着发酵产物浓度的增加而增加。经计算当发酵产物浓度为8.8 mg/mL时米渣蛋白发酵产物的羟自由基清除率为99.78%，表现出与Vc相似的自由基清除能力。罗非鱼鱼皮产物的IC50值为1.21mg/mL。
【主权项】
1.一种利用米曲霉发酵罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的方法，其特征在于:包括如下步骤:(1)预处理:清洗后的罗非鱼鱼皮经脱脂后，依次用0.1-0.13mol/L的盐酸溶液和.0.1-0.12mol/L的氢氧化钠溶液浸泡1_2小时； (2)水提:预处理后的鱼皮经洗涤至中性后，在45-50°C条件下，用1-2倍体积的蒸馏水恒温匀浆8-10小时后，抽滤提取上清液； (3)灭菌:提取的上清液在121°C条件下灭菌20分钟，然后冷却备用； (4)米曲霉发酵:种子液添加量为1_8%，在温度为28-31°C，pH为6-8条件下发酵50-80小时； (5)离心超滤:将上述发酵液于5000r/min离心20min后取上清液，于0.18MPa、40°C下采用分子量为lOkDa的超滤膜进行处理，得到超滤液； (6)冷冻干燥:将超滤液于-40?_50°C，真空度0~20Pa下进行冷冻干燥，即得到抗氧化活性肽产品。
【专利摘要】本发明涉及一种利用米曲霉发酵罗非鱼鱼皮制备抗氧化活性肽的方法，属于食品加工技术领域；以罗非鱼鱼皮为原料，经预处理、提取后，以米曲霉为发酵菌株对罗非鱼鱼皮进行发酵、而后经离心、超滤、冷冻干燥得到罗非鱼鱼皮抗氧化活性肽；其发酵条件为：以米曲霉为发酵菌株，种子液添加量为1-8%，在温度为25-31℃，pH为6-8条件下发酵50-80小时；本发明制备的罗非鱼鱼皮抗氧化活性肽抗氧化效果显著，其DPPH自由基和羟自由基的IC50值分别为1.09mg/mL和1.21mg/mL，是一种极具潜力的生物活性肽原料。
【IPC分类】C12R1/69, C12P21/06, C07K1/34
【公开号】CN105255982
【申请号】CN201510776208
【发明人】周金全
【申请人】周金全
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月13日