一种基于l型脱氧核酶生物体系中金属离子的检测试剂盒、检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于L型脱氧核酶生物体系中金属离子 的检测试剂盒、检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 对生物体内重金属离子灵敏、准确检测是人们一直努力的目标。除了传统的原子 吸收、质谱等方法，近年来，基于体外筛选技术，科学家门发展了一系列具有催化活性的DNA 结构（DNAzyme，中译文为脱氧核酶），由于这些DNAzyme的活性对特定的重金属离子具有强 烈的依赖性，人们因此发展了DNAzyme传感器用于重金属离子如铅、铜、汞、铀酰等的检测， 这些传感器灵敏度高，选择性好，设计简单，反应快速，因此受到了越来越广泛的关注。然 而，复杂的生理环境，限制了DNAzyme在体内的广泛应用。例如，生物基质中存在着大量的 核酸酶，这些核酸酶能够对外源DNAzyme产生非特异性攻击，使得DNAzyme无法稳定存在于 生理环境而报告出假阳性信号；其次，大量的蛋白质能够与DNAzyme非特异性结合，引起探 针结构变化，报告假阳性信号；第三，外源DNAzyme探针与体内核酸属于同一类型，为了避 免DNAzyme与体内其它非特异性的核酸序列产生杂交，需要对核酸探针进行序列的筛选和 优化，这对核酸探针的设计造成了一定的复杂性。
[0003] L-DNA是天然DNA，D型DNA的对映异构体。与D-DNA相比，L-DNA能够抵抗核酸 酶的降解、不与细胞内各种蛋白质产生非特异性结合，同时，L-DNA不会与D型核酸杂交，从 而减少了L-DNA核酸探针设计的复杂性等问题。基于L-DNA的诸多优良性质，我们考虑能 否设计L-DNAzyme用于生物体系中金属离子检测。根据手性底物特异性相关（reciprocal chiralsubstratespecificity)原理，如果物质A与B有特异性识别能力，那么A的镜像 A'则能够与B的镜像B'具有同样的识别能力。基于此，我们推断，如果物质A与B有特异 性识别能力，而B物质是非手性物质，则物质A的镜像A'应该对非手性的物质B具有同样 的识别能力。如果这个推断成立，那么当D-DNAzyme对金属离子具有特异性依赖而产生催 化活性时，其镜像结构：L-DNAZyme同样能够依赖该金属离子而产生催化活性，这样，我们 就能够将D-DNAzyme序列直接转变为L-DNAzyme序列，用于金属离子的检测与成像，而根据 前面的报道，L-DNA不会受到各种生物基质的干扰，从而发展一种生物体系中稳定存在的金 属离子传感器用于金属离子的准确、灵敏检测。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有D-DNAzyme易被生物基质干扰，对金属离子的检测容易产生假阳 性信号等问题，提出一种稳定、灵敏、特异性分析生物体系中金属离子的定量定性分析试剂 盒、方法和应用。
[0005] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0006] 所述基于L型脱氧核酶生物体系中金属离子的检测试剂盒中含有L-DNAzyme。所 述DNAzyme的序列包括酶链序列和底物链序列；所述酶链序列如SEQ ID NO. 1所示，所述底 物链序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0007] 所述检测生物体系中金属离子的方法是将特异性识别金属离子的D-DNAzyme序 列直接转换为L-DNAzyme，然后用L-DNAzyme进行金属离子的检测。所述DNAzyme的序列 包括酶链序列和底物链序列；所述酶链序列如SEQIDNO. 1所示，所述底物链序列如SEQ IDN0. 2所示。所述用L-DNAzyme进行金属离子的检测是将L-DNAzyme加入缓冲液中，配 成L-DNAzyme浓度为50nM的检测溶液，在荧光分光光度计进行定量检测时检测溶液的反应 体积为 200yL。所述缓冲液包括以下成分：50mMNaCl，50mMKCl，5mMMgCl2,50mMHEPES， pH7. 2或pH6. 65,具体来说，用于Pb(II)离子传感时包括以下成分：50mMNaCl，50mM KC1，5mMMgCl2, 50mMHEPES，pH7· 2 ;在血清中检测时，缓冲液盐离子组分相同，pH6· 65,血 清浓度为10%。在标准缓冲液中对Pb(II)的检测灵敏度为0. 7ηΜ，血清中为50ηΜ。
[0008] 下面对本发明作进一步说明：
[0009] 本发明将特异性识别金属离子的D-DNAzyme序列直接转换为L-DNAzyme，根 据手性底物特异性相关原理，该L-DNAzyme同样能够识别对应的金属离子，同时，结合 L-DNAzyme不会被生物基质干扰，实现生物体系中金属离子的定量分析。该L-DNAzyme能够 抵抗生物基质中各组分的干扰，避免假阳性信号的产生，是用于生物体系中金属离子检测 与成像的传感器。信号分子可以为FAM和Dabcyl，不存在金属离子时，标记在DNAzyme上的 FAM基团发出的荧光被Dabcyl淬灭，存在特定金属离子时底物链断裂，发出荧光信号。
[0010] 本发明包括如下内容：（1)根据已经报告的对金属离子特异性响应的D-DNAzyme 序列，设计合成出有荧光-淬灭基团标记的L-DNAzyme荧光探针（使用DNA/RNA自动合成 仪合成L-DNAzyme序列）；（2)证明L-DNAzyme具有对金属离子依赖的催化能力，并构建 缓冲液中L-DNAzyme对金属离子的检测体系（使用荧光分光光度计进行考察，反应体积为 200μL，DNAzyme浓度为50nM) ; (3)使用核酸酶、单链结合蛋白等具有代表性的生物基质干 扰物，证明L-DNAzyme不会受到生物基质的干扰；（4)提取血清，构建中金属离子的检测体 系（使用的血清浓度为10%，使用前进行无机酸消解）。（2) - (5)中金属离子参与的实验， 反应时间均为30min。
[0011] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0012] 首先，本发明是在手性底物特异性相关原理上的一个创新，证明了非手性物质在 对A物质响应的同时，也会对A的镜像A'起到同样的响应效果；
[0013] 其次，本发明不需要筛选、设计新的金属离子传感器，只需把已经筛选出的 D-DNAzyme序列合成出L-DNAzyme序列即可，设计简单、快捷；
[0014] 第三，借助于L-DNA能够抵抗生物基质干扰的优良性能，该方法能够用于生物体 系中金属离子的检测，解决了D-DNAzyme在生物体系中易被降解、干扰的困难；
[0015] 第四，本发明具有通用性，不仅对DNAzyme有特定响应能力的金属离子适应，其他 能够对DNA有特定识别能力的非手性物质，同样适用于该方法。鉴于设计简单、方法通用、 稳定性好、灵敏度高等优点，我们提出的基于L-DNAzyme用于金属离子的定量检测方法有 可能发展成为普及的金属离子定量检测工具。
【附图说明】
[0016] 图1A为本发明原理图。当特异性的金属离子能够催化D-DNAzyme的活性，切断底 物链时，该金属离子同样能够催化相对应的L-DNAzyme发生同样的活性。而D-DNAzyme易 被生物体系中各种生物学基质干扰时，L-DNAzyme能够抵抗这些干扰，从而能够发展生物体 系中稳定的L-DNAzyme传感器用于金属离子的检测。图1B为L-DNA以及D-DNA的结构，两 者呈镜像关系。
[0017] 图2A为铅离子依赖的DNAzyme的序列及结构。图2B为其对铅离子的响应示意 图。底物链上分别标记了荧光基团与淬灭基团，酶链上标记了淬灭基团。双链杂交，荧光被 淬灭。铅离子出现后，酶链切割底物链，荧光基团远离，发出荧光信号，从而有效报告铅离子 的存在。
[0018] 图3B的插图为聚丙稀酰胺凝胶电泳分析L-DNAzyme对底物链的切割活性。插 图通道1不加铅离子，通道2加入铅离子，可以看到铅离子的存在使得底物链被切断。图 3A为GR-5L-DNAzyme用于铅离子的定量检测。能够实现0. 72nM铅离子的检测。图3