：抓MYB25-qF和抓MYB25-qR。W泛素基因 (Ubiquitin)作为内标基因，扩增引物为抓UBQ7-F和抓UBQ7-R，如表6所示。
[0119] 使用英光定量PCR仪ABI7000(ABIPrism)进行实时定量PCR分析，每个样品3次 重复。PCR程序为 95°C3min;95°C5s，59°C20s，72°C15s，共 45 个循环；采用 2-AACT方 法对数据进行分析。实验进行3次生物学重复。
[0120] 3. 2. 5抓MYB25植物表达载体的构建和在洋葱表皮的亚细胞定位分析
[0121] 根据抓MYB25基因ORF序列和祀GAD的酶切位点设计引物，正向引物抓MYB25-NF 添加EcoRI酶切位点，反向引物GbMYB25-NR添加BamHI酶切位点。按照质粒小提试剂盒 操作步骤，提取pMD18-T-GbMYB25质粒。W该质粒为模板，进行PCR扩增。PCR体系与程序 同3. 2. 2。用EcoRI和BamHI双酶切植物表达载体祀GAD和抓MYB25回收产物，用T4DNA 连接酶16°C连接目的片段到植物表达载体中。构成祀GAD-GbMYB25瞬时表达载体。
[0122] 按照BiolisticPDS-1000/HeParticleDeliverySystem的方法用金粉包埋 DNA。按照参考文献的方法（化Z,HuZ,JiangQ,etal..GmNFYA3,atargetgeneof miR169,isapositiveregulatorofplanttolerancetodroughtstress[J].Plant molecularbiology, 2013, 82(1-2) :113-129.)制备转化质粒子弹并轰击洋葱表皮细胞，转 化后暗箱培养16~24h，制片，用LeicaMicrosystem激光共聚焦显微镜观察。
[0123] 3. 3结果与分析
[0124] 3. 3. 1抓MYB25基因ORF序列克隆及分析
[01巧]根据陆地棉GhMYB25序列设计引物，用RT-PCR方法，从海岛棉中获得同源序 列，将其命名为GbMYB25。GbMYB25编码区长93化P，编码309个氨基酸，预测分子量约为 34. 762kDa，等电点为8. 08。抓MYB25蛋白的N端区包含2个SANT保守结构域，分别位于第 13-63位和第66-114位氨基酸，该结构域为R2R3型MYB家族基因所特有的，因此该基因为 R2R3型MYB转录因子。
[0126] 利用GORIV程序预测蛋白质的二级结构，抓MYB25蛋白由309个氨基酸组成，其中 82个氨基酸可能形成a螺旋，60个氨基酸可能形成延伸带，167个氨基酸可能形成无规卷 曲。组成a螺旋、延伸带、无规卷曲的氨基酸比例分别为26. 54%，19. 42%和54. 05%。a螺 旋、延伸带、无规卷曲分布如图6所示。利用Swiss-P化Viewer(v3. 7)程序在SWISS-MO呢L 数据库中进行GbMYB25蛋白质的H级结构分析，得到该蛋白的H级结构图，如图7所示。
[0127] 同源性分析表明，海岛棉抓MYB25与陆地棉GhMYB25(Gossypiumhirsutum, ACJ07153. 1)之间的氨基酸序列一致性为99. 35%，相差两个氨基酸，抓MYB25与雷蒙德氏 棉（Gossypiumraimondii,ADZ98880)、亚洲棉（Gossypiumarboreum,ADZ98879. 1)、草棉 (Gossypiumherbaceum,AD巧5318. 1)、可可（Theobromacacao,XP_007046022. 1)和克莱 口抽（Citrusclementina，XP_006438735. 1)氨基酸序列一致性分别为 55. 91%、55. 64%、 55. 64%、65. 8%和56. 96%。送些相关蛋白除N端序列的保守性较高外，其他区域一致 性较低。
[0128] 图8系统发生树分析表明，抓MYB25和GhMYB25归为一组，表明海岛棉和陆地棉同 类基因的亲缘关系较近，而棉花雷蒙德氏棉、亚洲棉和草棉为一个分支。
[0129] 3. 3. 2抓MYB25基因DNA序列分析
[0130] 从新海21基因组DNA中克隆到了抓MYB25的基因组序列，如图9,利用DNAMAN软 件分析比对基因组与CDNA序列，结果表明，抓MYB25基因全长1，084bp，由3个外显子和2 个内含子组成。3个外显子的长度分别为133bp、13化P和66化P。第一个内含子的长度为 84bp，第二个内含子长度为69bp，分别插入在45G氨基酸之内和88R氨基酸之内。2个内含 子的左右边界均为GT-AG结构，送就保证了在RNA加工过程中内含子被正确识别和切除。
[0131] 3. 3. 3抓MYB25基因的表达特性
[0132] 为了分析GbMYB25基因的功能，采用实时定量PCR方法分析在开花当天的胚珠 和不同发育阶段棉纤维中GbMYB25基因的表达。如图10所示，GbMYB25基因在开花当天 的胚珠中的表达量比在不同发育时期的棉纤维中的表达量高。在发育不同阶段的棉纤维 中，GbMYB25基因在5化a的棉纤维中表达量明显高于其他发育时期的棉纤维，据此推测 GbMYB25基因可能在棉纤维起始发育阶段中具有一定的功能。
[0133] 3. 3. 4抓MYB25蛋白的亚细胞定位分析
[0134] 用载体Pspod分析GbMYB25基因编码蛋白的亚细胞定位，结果表明该蛋白中含有 一段核定位信号区（化巧。利用基因枪介导的方法将祀GAD-GbMYB25转化洋葱表皮后，发现 GbMYB25融合蛋白则只存在于细胞核内，而hGFP对照存在于洋葱表皮细胞质和细胞核中， 如图11所示，说明预测的GbMYB25蛋白的核定位信号区具有核定位的功能。
[0135]W上，海岛棉抓MYB25基因在开花当天的胚珠中优势表达，在抓PA的纤维中表达 量相比纤维发育其他时期表达量高，说明GbMYB25基因可能在棉纤维发育起始阶段具有参 与调控棉花纤维起始发育的功能。
[0136] 实施例四：海岛棉抓DET2基因的克隆及表达分析
[0137] 海岛棉（Gossypiumbarbadense)W纤维较细、结构致密、强度较高著称，在四个 棉属栽培种中纤维品质最优。细胞壁松弛和液泡膨压是纤维细胞持续性伸长的重要过 程，需要一些植物激素的调控（RuanYLLlewellynDJ,RirbankRT.IliecontrolOf single-celledcottonRberelongationbydevelopmentalIyreversiblegatingof PIasmodesmataandcoordinatedexpressionofsucroseandK^transportersand expansin[J].PlantCell, 2001, 13(1) :47-60.)。本申请在转录组、表达谱分析的基础上， 为了研究海岛棉纤维发育相关基因的功能，利用基因工程调控棉花中内源BRs,改良棉花纤 维的产量和品质。我们W12个海岛棉品种为材料，开展了BRs生物合成的限速酶基因一类 固醇5a-还原酶基因值ET2)的克隆及相关特征分析研究。并对不同发育时期棉花纤维中 的表达模式进行了研究，为进一步阐明类固醇5a-还原酶调节内源BRs在棉花纤维发育进 程中的作用，并为棉纤维发育和棉纤维品质形成过程中的重要功能奠定重要的理论基础。
[0138] 4.1材料和方法
[0139] 4. 1.1实验材料
[0140]供试材料新疆品种（军海1号、新海21号和新海36号）、美国品种（pima90-5379、 pimas-7和pimas09353)、埃及品种（吉扎1号、吉扎30号和吉扎69号）W及前苏联品种 (9078依、C-6019和司-6002)种植于试验田，常规大田管理。在棉花盛花期中分别对棉铃挂 牌标记，取开花后不同天数（〇、5、10、15和2抓PA)的棉铃，将胚珠立即投入液氮速冻，-8(TC 超低温冰箱保存。
[01川 4. 1. 2RNA的提取和cDNA的制备
[0142] 按Trizol试剂说明书，提取不同发育时期的纤维样品总RNA，经面aseI处理潜在 的DNA污染，1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。CDNA第一链的合成操作步骤按照TaKaRa公司M-MLV反转录试剂盒说明书进行。
[014引 4. 1.3基因的克隆
[0144] 针对陆地棉、葡萄、马铃墓等BRs基因序列的保守区设计特征引物，并由生工生物 工程有限公司合成。W抓DET2-F(SEQIDN0;13)和抓DET2-R(SEQIDN0;14)为引物，cDNA 第一链为模版进行PCR扩增。
[0145] 反应程序：
[0146] 94°C预变性 5min;94°C变性 30s;59°C退火 45s;72°C延伸 60s;30 个循环；72°C延 伸7min，于4°C保存。
[0147]PCR产物经1 %的琼脂糖凝胶检测，利用天根公司凝胶回收试剂盒纯化，回收产物 连接到天根公司的克隆载体pGM-T，通过转化大肠杆菌D册a，经藍白斑筛选挑取白斑过夜 摇菌，提取质粒酶切鉴定，鉴定正确的阳性克隆由生工生物工程有限公司完成测序。
[014引4. 2基因的生物信息学分析
[0149] 利用DNAMN软件分析不同物种来源的同源基因，搜索最大开放阅读框的pen Reading化ame，0RF);在NCBI数据库中对推导出的氨基酸序列进行Bias巧比对 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，分析该氨基酸序列与其他物种的同源性；利用 P;ro1:Param程序（ht1:p://web.expasy.org/protparam/)进行推导氨基酸保守结构域及性 质；利用ClustalW和MEGA5. 0软件输出同源比对和进化树构建结果。
[0150] 4.2. 1基因的表达分析
[0151] 根据基因序列特征设计实时英光定量引物抓DET2-QF和抓DET2-QR，如表7所示， W棉花泛素基因7(ubiquitin7) 0JBQ7,登录号：DQ116441)作为内参基因，设计引物UBQ7-F 和UBQ7-R。W不同发育时期的棉纤维cDNA为模板，采用TaKaRa公司的PrimeScriptRT reagentKit.SYBRGreen试剂盒，利用Life公司的 7500化3*RealPCRSystem实时英光 定量PCR仪进行扩增。分析该基因在棉纤维中的表达情况。反应程序；94t：预变性5min， 94°C变性15s，6(rC退火20s，72°C延伸20s，40个循环。每次实验设H个重复，实验结果按 照2-AACt法进行分析。
[0152] 表7引物
[0154] 4. 2. 2抓DET2基因的克隆与序列分析
[01巧]设计引物，W新海21号IODPA的纤维组织CDNA为模板，通过PCR扩增，获得的DNA片段约为80化P。经序列分析，此DNA片段包含一个77化P的0RF，编码一个258个氨基酸 的蛋白质。Pro巧aram程序分析该蛋白分子式为。463恥13吨47〇34751〇,分子量为30. 43kDa，理 论等电点是9. 35,属于稳定类蛋白。
[0156] 为了确定该序列与不同物种的类固醇5a-还原酶的同源性，将氨基酸序列在 NCBI数据库中进行比对，结果表明该序列与陆地棉DET2的同源性最高，为98. 45%，与拟南 芥、葡萄、马铃墓等物种的DET2基因的同源性在60 %~6