一种提高剑麻斑马纹病抗性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高剑麻斑马纹病抗性的方法，具体涉及一种从牵牛花中克隆橡 胶素类多肽蛋白酶基因AFP1和AFP2及其在提高剑麻抗性中的应用，尤其适用于在剑麻抗 斑马纹病中的应用，属于转基因技术领域。
【背景技术】
[0002] 剑麻是主要的热带纤维作物，是当今世界用量最大、范围最广的一种硬质纤维，其 纤维质地坚韧，具有拉力强、抗撕裂、耐磨、耐腐蚀、耐盐碱等特性，广泛应用于国防、航海、 交通运输、石油、冶金等领域，剑麻茎心是酿造龙舌兰酒的主要原料，剑麻麻渣含有较高皂 素，可用来制药，同时剑麻也是一种重要的生物质能源，有非常重要的经济价值。
[0003] 剑麻原产于墨西哥等热带、亚热带地区，我国保存的种质资源有80余份，种质资 源严重缺乏。目前的主栽品种H. 11648是1963年从坦桑尼亚引进，其种植面积占剑麻总面 积的98%以上。由于该品种抗真菌能力差，加上单一品种多年种植，品种退化严重，病虫害 不断滋生，严重影响了剑麻产业的发展，因此培育出抗病高产品种或对现有品种遗传改良 已迫在眉睫。
[0004] 剑麻生命周期长，一生仅开一次花，花期不遇现象普遍存在，加上我国剑麻种质资 源严重缺乏，多倍体广泛存在，要在短期内培育出高产抗性强的品种十分困难。因此，寻求 高效快速的方法便成了育种学家们的首要任务，同时也是剑麻产业中的主要问题之一。
[0005] 随着分子生物学的迅速发展，各种技术方法日益成熟和完善，利用基因工程技术 对现有种质资源进行遗传改良已广泛应用于作物育种中，并在拟南芥、番茄、马铃薯、水稻 等作物中已有许多成功的报道，同时也为剑麻生物技术育种提供了参考。
[0006] 植物多肽抗生素是一类对细菌、真菌等微生物及某些昆虫和动植物细胞具有抑制 或杀灭作用的小分子多肽，其结构和组成复杂多样，目前已发表的植物多肽抗生素主要有 荠菜素、环肽、脱皮素、硫素、植物防御素、转脂蛋白、橡胶素、打结素和凤仙花素，其中橡胶 素为含有29-44aa，可能含有3对、4对或5对二硫键的小分子多肽。研究表明橡胶素对 革兰氏阳性菌和真菌表现出抗性。曾有报道称，在千穗谷苋菜中克隆了一个橡胶素类多肽 Ah_AMP2基因，该基因在烟草中表达后，可提高烟草对烟草青枯病和黑胫病的抗性。
[0007] 剑麻斑马纹病主要致病菌为烟草疫霉，田间病株多数从叶片开始，进而麻茎、叶轴 均会受到侵染，引起叶片坏死、茎腐和轴腐，进而导致整株死亡，此病迅速蔓延，极易造成极 大经济损失。传统的防治方法还是采用农业措施、化学药剂防冶相结合的综合防冶措施，从 牵牛花中克隆橡胶素类多肽蛋白酶基因AFP1和AFP2用于提高剑麻抗性还未见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种提高剑麻斑马纹病抗性的方法， 本方法通过基因工程手段，将外源基因导入剑麻中，通过转基因技术获得具有一定抗性的 转基因剑麻植株，本发明为提高剑麻斑马纹病的抗性提供了一条新的有效途径。
[0009] 为实现上述目的，本方法采用的技术方案是： 1.橡胶素类多肽蛋白酶基因AFP1和AFP2的克隆 以牵牛花成熟种子为材料，采用改良Trizol法提取总RNA，经Ferments公司反转录试 剂盒合成第一链cDNA后，采用RT-PCR的方法克隆AFP1和AFP2基因，AFP1和AFP2基因全 长分别为279bp和276bp，编码92个氨基酸和91个氨基酸，AFP1和AFP2同源性高达95%以 上，均含有41个氨基酸的小分子信号肽。AFP1和AFP2核酸和氨基酸序列见SEQIDNo. 1、 SEQIDNo.2、SEQIDΝο·3、SEQIDΝο·4。
[0010] 2.植物表达载体构建 设计带酶切位点的引物，以第一链cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因AFP1和AFP2， 通过定向酶切和与载体PISV2678连接，并电击转化农杆菌EHA105,构建含有目的基因AFP1 和AFP2的植物表达载体。表达载体图谱见附图1。
[0011] 3.农杆菌介导法转化剑麻 以剑麻H. 11648愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导法浸染愈伤组织，然后将浸染 后的愈伤组织接种在含有卡那霉素（kan+)和除草剂（Basta)的不定芽诱导培养基上诱导 不定芽，待不定芽长到4-6厘米高时，转入生根培养基上进行生根。愈伤组织诱导培养基 为：MS基本培养基+0. 1-1.Omg/L萘乙酸NAA+1. 0-3. 5mg/L6-苄氨基腺嘌呤6-BA，不定芽 诱导培养基为：SH基本培养基+1.0-5. 0mg/L6-苄氨基腺嘌呤6-BA+0-1.5mg/L萘乙酸 NAA+0-1.5mg/L吲噪 3 丁酸IBA+ 200mg/L卡那霉素kan++ 250Kg/L除草剂Basta，生根 培养基为添加200mg/L羧苄霉素的MS基本培养基。培养基的pH为5. 8-6. 0 ;光照12-14h， 黑暗10-12h，光照强度为2000Lux，温度28±2°C。待再生植株长出4-5条壮根时，移植到 基质为椰糠和河沙(椰糠：河沙=1:1)的塑料遮光大棚中继续培育。
[0012] 4.剑麻转化植株的鉴定 取1克转基因植株叶片提取基因组DNA，以DNA为模板，以AFP-F和AFP-R为引物，以非 转基因植株为阴性对照，经PCR检测后发现基因AFP1和AFP2已经成功转入剑麻。AFP-F: 5' -CACAACAGTGTGGGAGTCAAGCC-3'；AFP-R:5' -CGGTTGATTGGTTTGCAGTGGTAG-3'。PCR检测 结果见附图2d。
[0013] 5.剑麻转化植株抗病性检测 采用叶面针刺法活体和离体接种烟草疫霉菌，48小时候后观察病斑扩展情况，发现转 基因植株叶片病斑明显比非转基因植株小。发病情况见附图2f、附图2g和附图2h。
[0014] 6.剑麻转基因植株重要防御酶活性测定 采用叶面针刺法活体接种烟草疫霉菌，在接种0小时、24小时、48小时和72小时分别 测定转基因和非转基因植株超氧化物歧化酶（S0D)、过氧化物酶（P0D)、过氧化氢酶（CAT) 和多酚氧化酶（ΡΡ0)的活性，发现转基因植株参与活性氧清除的过氧化物酶POD和过氧化 氢酶CAT的活性，参与酚类化合物和木质素合成的多酚氧化酶ΡΡ0的活性明显比非转基因 植株高。具体酶活见附图3。
[0015] 本发明的有益效果是：本研究利用分子生物学的方法，从牵牛花中分离橡胶素类 多肽蛋白酶基因AFP1和AFP2并转入剑麻，提高剑麻抵抗斑马纹病的能力，与非转基因剑麻 相比，本发明转AFP1和AFP2基因剑麻在接种烟草疫霉菌后病斑明显变小，抗性明显增强； 参与活性氧清除的过氧化物酶P0D和过氧化氢酶CAT的活性，参与酚类化合物和木质素合 成的多酚氧化酶PPO的活性明显比非转基因植株高，为解决剑麻产业中斑马纹病的发生问 题具有重要的理论和现实意义。
【附图说明】
[0016] 图1表达载体构建路线图； 图2转基因剑麻的筛选，PCR检测和病原菌接种； 其中a为转基因抗性愈伤组织的筛选；b为转基因抗性植株的筛选；c为转基因植株的 移栽；d为转基因植株的PCR检测；e为转基因植株活体接种烟草疫霉菌；f为转基因植株叶 片接种烟草疫霉菌；g为非转基因植株接种烟草疫霉菌48小时后的发病情况；h为转基因 植株接种烟草疫霉菌48小时后的发病情况； 图3病原侵染过程中重要防御酶CAT、POD、S0D、ΡΡ0活性变化情况； 其中a为过氧化氢CAT酶活、b为过氧化物P0D酶活、c为超氧化物歧化酶S0D酶活、d为多酸氧化酶ΡΡ0酶活。
【具体实施方式】
[0017] 下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限 制本发明的范围。
[0018] 实施例1 本发明所提供的2个橡胶素类多肽蛋白酶基因AFP1和AFP2,均从牵牛花中克隆得到， 其核酸序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2 (序列1和序列2)。
[0019] AFP 1和AFP2基因编码的蛋白质，命名为AFP 1和AFP2蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNo.3和SEQ IDNo.4(序列3和序列4)。
[0020] 一.橡胶素类多肽蛋白酶基因（AFP1和AFP2)的克隆 上述AFP1和AFP2基因的克隆包括如下步骤： 1.RNA提取 取1克牵牛花成熟种子加入0. 1克PVP40,迅速用液氮研磨成粉末， 加入4mL70%丙酮（2%β-疏基乙醇)，充分混勾，8000rpm，10 °C离心3min，重复1-2次。 然后加入4 1^1^加1裂解液，室温放置51^11，加入800卜1^酚：氯仿：异戊醇（25:24 :1)， 混勾后12,000rpm离心10min，取上清，加入800PL氯仿：异戊醇（24:1)抽提，最后加入2 mL异丙醇室温静置30min以沉淀核酸，沉淀经70%乙醇和无水乙醇各洗涤1次后用ddH20 溶解，取2μL总RNA在含有Goldenview的1. 5 %琼脂糖凝胶中电泳10分钟，并拍照保 存。其余的RNA-80°C保存备用。
[0021] 2. RT-PCR克隆AFP1和AFP2基因 具体步骤如下： 取1克总RNA，采用Ferments公司的反转录第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA，具体 操作按照说明书进行。然后以cDNA为模板，根据已报道的基因序列设计特异性引物，用 Transgene公司的pfu高保真酶进行特异PCR扩增，50yL反应体系：10yL5Xbuffer， 5yLdNTP(10mmol/L)，上下游引物（10μ mol/L)各 1yL，酶（5U/L) 1yL，cDNA2 yL，水 29yL。反应程序为 95°C5min，[95°C30s，52°C30s，72°C40s] 30 个 循环，72°C10min。所用AFP1 正向引物：5'-ATGAAATACTGTACTATGTT-3'，AFPl反向引物 5'-TCAGTTGGCACCGCCGGCGG-3'。AFP2正向引物和反向引物分别与AFP1正向引物和反向 引物序列相同。
[0022] 取10yLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增片段大小