，剩余40yL采用宝 生物公司的凝胶回收试剂盒回收，取2μL回收产物16°C与PMD19-18载体连接2~4h，连 接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，采用蓝白斑筛选阳性转化子，经PCR检测后送公司 测序，测序结果证实所得到的序列为牵牛花橡胶素类多肽蛋白酶基因AFP1和AFP2。核酸和 氨基酸序列如SEQIDN0. 1、SEQIDN0. 2、SEQIDN0. 3、SEQIDN0. 4。
[0023] 二.含AFP1和AFP2基因植物表达载体构建 构建含有AFP1和AFP2基因的植物表达载体，采用农杆菌浸染法转化剑麻，获得转AFP1 和AFP2转基因剑麻，从而提高剑麻对斑马纹病的抗性。
[0024] 1.带酶切位点编码区的扩增 设计带酶切位点的引物，引物序列如下： 正向引物AFPIF: 5 ' -GCTCTAGAGCATGAAATACTGTACTATGTT-3 ' ； 反向引物AFP1R:5'-CGGAATTCCGTCAGTTGGCACCGCCGGCGG-3' ； 正向引物AFP2F5 ' -CGGAATTCCGATGAAATACTGTACTATGTT-3 ' ； 反向引物AFP2R5 ' -CCCTCGAGGGTCAGTTGGCACCGCCGGCGG-3 ' ； 以第一链cDNA为模板，分别采用AFP1F和AFP1R、AFP2F和AFP2R为引物扩增目的基因AFP1 和AFP2〇
[0025]PCR反应体系为：50yL反应体系：10yL5Xbuffer，5yLdNTP(10mmol/L)， 上下游引物（10ymol/L)各 1yL，酶（5U/L) 1yL，cDNA2yL，水 29yL。
[0026]反应程序为95°C5min，[%°C30s，58°C30s，72°C40s] 3〇 个循环， 72°C10min〇
[0027]PCR产物切胶纯化后与pBS-T载体连接，连接产物命名为pBS-AFPl和pBS-AFP2， 转化大肠杆菌JM109感受态后，采用蓝白斑筛选转化子，取白斑进行PCR检测后送公司测 序，测序结果证实得到的转化子分别为带酶切位点的AFP1和AFP2基因。
[0028] 2.植物表达载体构建 用限制性内切酶XbaI和EcoRI双酶切含有APF1目的基因的重组质粒pBS-AFPl和 植物表达载体PISV2678,回收目的片段并连接，转化大肠杆菌T0P10感受态后，采用蓝白斑 筛选转化子，取白班进行PCR检测后送公司测序，测序结果证实得到的转化子为带酶切位 点的PISV2678-AFP1单价表达载体。
[0029] 用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切pBS-AFP2和pISV2678-AFPl表达载体， 回收目的片段并连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，经PCR鉴定后送公司测 序，若所测序列含有目的基因，则证明植物表达载体构建成功。
[0030]PCR扩增引物为：上游引物AFP-F: 5 ' -CACAACAGTGTGGGAGTCAAGCC-3 ' ；下游引 物AFP-R: 5'-CGGTTGATTGGTTTGCAGTGGTAG-3'。PCR反应体系为：20yL反应体系：2yL 10Xbuffer，2yLdNTP(10mmol/L)，上下游引物（10μ mol/L)各 0.5yL，酶（5U/L) 0.2yL，质粒DNA2yL，水 12.8yL。反应程序为 95°C5min，[95°C30s，56°C 30s，72°C40s] 30 个循环，72°C10min。
[0031] 3.植物表达载体导入农杆菌 采用电击转化的方法将植物表达载体导入根癌农杆菌EHA105中，具体步骤如下： 农杆菌感受态细胞的制备 (1)挑取根癌农杆菌EHA105单菌落接种于含有10μg/ml利福平和100mg/l卡那霉素 的3mLLB液体培养基中，28 °C，220rpm震荡培养过夜。
[0032] (2)取lmL过夜培养的菌液加到200lmL含有同样抗生素的LB培养基中，28 °C， 220rpm震荡培养3-4小时，直至0D600在0. 4至0. 8之间。收集菌液并分装于50ml离心管 中，冰上放置15-30分钟（说明：接下来的操作均在冰上进行，所用试剂和耗材必须提前预 冷)。
[0033] (3) 4°C4000rpm离心15分钟。弃上清，加入等体积的无菌水悬浮细胞，冰上放 置10分钟。
[0034] (4)4°C4000rpm离心15分钟，弃上清，加入1/2体积的无菌水，悬浮细胞，冰上 放置10分钟。4°c4000rpm离心15分钟，弃上清，加入1/4体积的无菌水，悬浮细胞，冰 上放置10分钟。
[0035] (5)4°C4000rpm离心15分钟，弃上清，加入1-2mL无菌水（0D600=0.4加1mL， 0D600=0.8加2mL)悬浮细胞，加入DMS0至浓度为7%，混匀后即为电击用农杆菌EHA105感 受态。将上述感受态细胞分装于1.5mLEP管中，液氮速冻后-80°C保存备用。
[0036] 电击转化 将电击杯清洗干净后用75%酒精浸泡2小时，然后用无水乙醇冲洗，晾干备用。
[0037] 取2yL质粒DNA于40yLEHA105感受态中，轻打混匀后移入预冷的电击杯中， 1800V电击，直到啪的一声电击完毕。
[0038] 迅速加入1 mL LB液体培养基至电击杯中，混匀，将混合液转入1.5mL EP管中， 28 °C，120rpm轻摇2-4小时。
[0039] 取适量菌液涂布于含50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上， 28°C培养36-48小时。并对菌落进行PCR检测。剩余的菌液-80°C保存备用。
[0040] 三.农杆菌介导法转化剑麻 以剑麻H. 11648茎尖愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导法转化剑麻。具体步骤如 下： 取保存于实验室的剑麻无菌苗茎尖，切成3mmX5mm大小，接种于愈伤组织诱导培养 基(培养基组成：MS基本培养基+3. 0mg/L6-BA+0. 2mg/LNAA)上培养，每天光照12-14小 时，暗培养10-12小时，光照强度2000Lux，培养温度为28±2°C。待愈伤组织长出后，挑取 色泽鲜艳的浅黄绿色愈伤组织，将其切成1/2绿豆大小后接种在愈伤组织诱导培养基中， 作为转化的受体。
[0041] 取保存于-80 °C的菌液适量，涂布于含50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB 固体培养基上，28 °C培养36-48小时。挑取单克隆于添加有50mg/L利福平和100mg/L 卡那霉素的LB液体培养基中，200rpm，28 °C培养，待吸光度0D600值在0. 6-0. 8之间，5000 rpm离心，收集菌体，然后加入1mLMS液体基本培养基重悬菌液，最后加入20mL添加有 200mg/L的乙酰丁香酮AC的MS液体基本培养基，混匀后作为转化浸染液备用。
[0042] 将提前准备好的剑麻H. 11648愈伤组织转入三角瓶中，快速加入转化浸染液后摇 匀，150rpm震荡15min，过滤，用滤纸吸干，然后将浸染后的愈伤组织接种在MS基本培养 基+3. 0mg/L6-BA+0. 2mg/LNAA+200mg/L的乙酰丁香酮AC的培养基中共培养2-3天，用 无菌水洗三遍后滤纸吸干，最后将愈伤组织转入含有卡那霉素（kan+)和除草剂（Basta)的 不定芽诱导培养基上诱导不定芽，待不定芽长到4-6厘米高时，转入生根培养基上进行生 根，愈伤组织诱导培养基为：MS基本培养基+0. 1-1. 0mg/L萘乙酸NAA+1. 0-3. 5mg/L6-苄 氨基腺嘌呤6-BA，不定芽诱导培养基为：SH基本培养基+1.0-5.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤 6-BA+0-1.5mg/L萘乙酸NAA+0-1.5mg/L吲哚3丁酸IBA+ 200mg/L卡那霉素kan++ 250 除草剂Basta。生根培养基为添加200mg/L羧苄霉素的MS基本培养基。培养基的pH 为5.8-6. 0;光照12-14h，黑暗10-12h，光照强度为2000Lux，温度28±2 °C。待再生植 株长出4-5条壮根时，将其置于自然条件下炼苗1周，然后将其移出，洗净基部残留的培养 基，用3%高锰酸钾浸泡1-3min后移植到基质为椰糠和河沙(椰糠：河沙=1:1)的塑料遮 光大棚中，大棚遮光度75%，白天最高温度不超过32°C，夜晚最低温度不低于20 °C，每天早 晚各浇透水1次，再生植株的成活率在90%以上，幼苗长出新叶后开始追施2%复合肥水肥， 施肥后用清水喷淋一次，待幼苗长出新叶3片、苗高10cm即移栽到育苗盆中继续培育。
[0043] 四.转基因植株PCR检测 取1克转基因植株叶片，采用天根生化科技公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取基 因组DNA，以DNA为模板，以AFP-F和AFP-R为引物，以非转基因植株为阴性对照，PCR反应 体系为：20yL反应体系：2yL10Xbuffer，2yLdNTP(10mmol/L)，上下游引物（10 μ mol/L)各 0.5yL，酶（5U/L) 0.2yL，质粒DNA2yL，水 12.8yL。反应程序为 95 °C5min，[95°C30s，56°C30s，72°C40s] 30 个循环，72°C10min。：经PCR检测 后发现基因AFP1和AFP2已经成功转入剑麻。PCR检测结果见附图2d。
[0044] 五.转基因剑麻斑马纹病抗性鉴定 1.转基因剑麻离体叶片斑马纹病抗性鉴定 取转基因剑麻叶片和非转基因剑麻叶片，冲洗干净后晾干，采用叶面针刺法接种烟草 疫霉菌，48小时后观察斑马纹病发病情况。具体步骤如下： 用灭菌的大头针将叶片正面的表皮刺破，将菌饼的菌丝生长面贴在针刺的位置，用无 菌湿棉花覆盖后放入托盘中，用保鲜膜把整个托盘覆盖后，置于28°C，湿度80%以上的条件 下培养，48小时后测量病斑大小。结果发现，接种24小时后非转基因剑麻叶片明显出现病 斑，48小时后病斑扩展迅速，病斑大小均在3厘米以上（附图2f)，而转基因剑麻叶片病斑明 显比非转基因剑麻病斑小，病斑大小均在〇. 8-2厘米之间（附图2f)。即转基因剑麻叶片抗 斑马纹病的能力明显比非转基因剑麻强。
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