一种信号肽及其在利用魔芋粉产l-鸟氨酸重组菌中的应用
【技术领域】
[0001] 利用一种信号肽使重组菌高效分泌特定酶代谢廉价碳源进行氨基酸生产的方法 和高效生产某种蛋白的方法，属于基因工程、蛋白质与酶工程和代谢工程领域。
【背景技术】
[0002] 魔芋粉，主要含魔芋葡甘露聚糖，其来源是非粮食作物魔芋。据相关报道在我国云 南、贵州、四川、湖北和湖南的西部、陕西南部等地均适宜魔芋种植，目前已有一定的规模， 仅湖北省魔芋种植面积就达41万亩。目前魔芋粉主要用于部分食品，其水解低聚糖可作为 功能性食品，应用还不是很广泛。大部分微生物无法直接利用，因此，改造微生物利用魔芋 作为碳源发酵生产高附加值产品具有良好的应用前景。现国内外已有报道，改造酿酒酵母 直接以淀粉为碳源生产乙醇，导入α-淀粉酶基因使谷氨酸棒状杆菌利用可溶性生产L-赖 氨酸的相关报道，未见有以魔芋粉底物的相关微生物改造。
[0003] 发明人前期工作已获得通过相关基因工程和代谢工程技术改造的高产L-鸟氨酸 的菌种：钝齿棒状杆菌CGMCCNO. 0890/pargI，并申请发明专利：一种利用重组钝齿棒杆菌 一步发酵法生产L-鸟氨酸的方法。
[0004] 发明人获得的高产L-鸟氨酸的菌种只能以葡萄糖为主要碳源发酵生产L-鸟氨 酸，不能直接利用魔芋粉作为主要碳源。
[0005] L-鸟氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸，可促进蛋白质的合成以及糖类和脂质的 分解代谢并对肝脏的解毒功能具有重要的保障作用。通过基因工程和代谢工程技术进一步 改造高产L-鸟氨酸菌种，使其能利用魔芋粉作为碳源发酵生产L-鸟氨酸。对简化L-鸟氨 酸生产工艺、节约生产成本有一定的参考应用价值。
【发明内容】
[0006] 本发明通过基因工程技术将去除自身信号肽的甘露聚糖酶基因与来源谷氨 酸棒状杆菌和枯草芽孢杆菌的Sec和Tat两个主要分泌途径的十二条信号肽分别融合，替 换对比不同信号肽引导分泌β-甘露聚糖酶基因在不同L-鸟氨酸高产菌的效果，得到经密 码子优化的β-甘露聚糖基因信号肽--Mannase Signal Peptide (MSP)为分泌胞外酶效 果较好的一种新发现信号肽。
[0007] 所述MSP核苷酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列。
[0008] 本发明在已有高产L-鸟氨酸菌种的基础上，通过基因工程技术不同信号肽引导 分泌β-甘露聚糖基因在构建的不同L-鸟氨酸高产菌中表达。使其能以魔芋粉和葡萄糖 作为混合碳源发酵生产L-鸟氨酸。
[0009] 所述高产L-鸟氨酸菌种为本研究室前期构建的钝齿棒状杆菌CGMCCΝ0.0890/ pargI〇
[0010] 本发明构建的重组钝齿棒状杆菌CGMCCNO. 0890/pargI-pMSPman优化后5L发酵 96hL-鸟氨酸的产量为23. 5±0. 7g/L，发酵液中β-甘露聚糖酶的酶活为1358±3. 7U/mL。 (碳源添加方式：初始l〇g/L魔芋粉和50g/L葡萄糖，后期分批补加90g/L魔芋粉）。
[0011] 所述的技术方案：
[0012] 1.根据NCBI上公布的相关基因序列设计信号肽和目的基因融合引物。
[0013] 2.重组菌的构建
[0014] 从相关菌种中抽提染色体DNA为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩 增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，琼脂糖核酸凝胶电泳 检验回收产物的浓度。用相同的限制性内切酶相关表达载体和纯化后的PCR产物进行双酶 切，琼脂糖核酸凝胶电泳检测酶切产物并用凝胶回收试剂盒对其回收，并用超微量分光光 度计检测其浓度。将酶切后的载体和PCR产物按一定比例混合，在T4DNA连接酶的作用下 过夜连接。将连接产物用CaCl2转化法转入E.coliBL21，获得含重组质粒的E.coliBL21。 提取质粒，通过单双酶切及PCR验证后用电转化方法将重组质粒导入相关菌种中。最后，将 含15%甘油的重组菌液保存-70°C冰箱。
[0015] 3.重组菌的产酸培养
[0016] 将重组菌接种于新鲜的LB+0. 5%Glucose液体培养基中进行活化，接种量为1 %。 次日以1%转接于发酵培养基中（底物为可溶性淀粉和葡萄糖混合），0.8mMIPTG诱导表 达，生长后期收集发酵液利用氨基酸自动分析仪测定其氨基酸含量（L-鸟氨酸及相关氨基 酸等）。发酵培养基具备微生物生长所需的营养成分，并通过相关优化。
[0017] 4.重组菌的产酶培养
[0018] 将重组菌接种于新鲜的LB+0. 5%Glucose液体培养基中进行活化，接种量为1 %。 次日以1 %转接于发酵培养基中（底物为葡萄糖），0. 8mMIPTG诱导表达，生长后期收集发 酵液测其酶活和蛋白含量。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1 :信号肽引物与β-甘露聚糖酶串联的引物设计
[0020] 根据NCBI上公布的相关基因序列和β-甘露聚糖酶基因序列设计信号肽和基因 串联的大片段引物。
[0021] Pl:pMSPmanHindIIIF
[0022] 5'-CCCAAGCTTATGTTCAAGAAGCACACCATCTCCCTGCTGATCATCTTCCTGCTGGCT
[0023]TCCGCTGTTCTGGCTAAGCCAATCGAGGCTCATACTGTGTCGCCTGTGAATC-3 '
[0024] P2:pMSPmanHindIIIR
[0025] 5' -CCCAAGCTTTTACTCAACGATTGGCGTTA-3'
[0026] 实施例2 :β-甘露聚糖酶基因信号肽替换及其克隆
[0027] [1]从Β.subtilisCCTCCΜ209200 提取染色体作为模板DNA。
[0028] [2]根据NCBI网站上公布的β-甘露聚糖酶基因序列设计信号肽和基因串联的 PCR引物。以B.subtilisCCTCCΜ209200的基因组为模板利用大片段引物PCR，得到带有 经密码优化的核苷酸序列如SEQIDΝ0:1所示Mannasesignalpeptide(简称MSP)信号肽 的β-甘露聚糖酶基因。PCR扩增体系（50yL):模板lyL，上下游引物各0. 5yL，dNTPMix 4μL，10XExTaqBuffer5μL，灭菌ddH20 38. 5μL，ExTaqDNA聚合酶 0· 5μL。PCR反 应条件：94°C预变性，5min，一个循环；94°C变性，3〇8,56°(：退火，3〇8,72°(：延伸，11^113〇8， 30个循环；72°C，10min，一个循环；4°C，10min，一个循环（其中退火温度和延伸时间根据不 同引物和基因进行相对的调节）。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检 验回收产物的浓度。回收产物存放在1. 5mL的离心管中，-20°C冰箱保存备用。
[0029] 实施例3 :重组质粒pDXWlO-MSPman的构建
[0030] [1]构建重组质粒pMD18-T-MSPman，导入E.coliJM109。将[2]中PCR回收的产 物与克隆载体PMD18-T连接，连接体系为solutionI5μL，目的基因4. 8μL，pMD18-T质 粒0. 2μL，16°C过夜连接。连接接产物转化E.coilJM109,涂布于含100ug/mL氨苄青霉素 的LB平板，经37°C培养过夜，挑取单菌落到含100ug/mL氨苄青霉素的10mL液体LB培养 基中，37°C摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-MSPman，经PCR和酶切验证连接成功 后，将菌液加入甘油于-70 °C冰箱保藏。
[0031] [2]将[1]中提取的pMD18-T-MSPman质粒与表达载体pDXWlO分别进行Hindlll 与EcoRI的双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，获得重组质粒pDXWlO-MSPman。 上述重组质粒都通过PCR和酶切验证。
[0032] 实施例4:重组质粒pDXWlO-MSPman电转化至钝齿棒状杆菌CGMCC N0.0 890/pargI
[0033] 挑取钝齿棒状杆菌CGMCCNO. 0890/pargI分别接种于10mLLB液体培养基摇瓶 中，30°C摇床培养过夜，取100μL过夜培养的菌液，接种于50mL的感受态培养基中，30°C摇 床培养4h至0D562nm= 0. 9左右，用无菌管离心去上清，再用10%的甘油悬浮菌体并离心， 重复此步骤3次。最后分装于1. 5mL的离心管，加入3uL重组