] 2.转基因剑麻活体斑马纹病抗性鉴定 为了进一步检测转基因剑麻抗斑马纹病的能力，采用活体接种法直接将菌斑接种在转 基因剑麻叶片上，用湿棉花覆盖，用保鲜膜保湿，每2小时加一次水，48小时后测量病斑大 小。结果表明：转基因剑麻的病斑明显比非转基因剑麻病斑小，说明转基因剑麻的抗烟草疫 霉菌的性能比非转基因剑麻强。即采用转基因的方法，将橡胶素类多肽蛋白酶基因转入剑 麻中，可提高剑麻对斑马纹病的抗性（附图2e，2g，2h)。
[0046] 六.转基因剑麻防御酶活性测定 取盆栽的转基因剑麻植株和非转基因剑麻植株，采用活体接种法接种烟草疫霉菌，分 别在接种0小时，24小时、36小时和48小时取叶片，液氮研磨后保存于-80°c备用。
[0047] 取保存于_80°C样品0.5g，放入预冷的研钵中，加2mL预冷的提取液(含有1%聚 乙烯吡咯烷酮的〇.05mol/L磷酸缓冲液，pH7. 8)及适量的石英砂，冰浴下研磨成浆，再加 提取液冲洗2-3次(提取液总体积为5ml)，转入离心管。于4°C10000rpm下离心15 min， 上清液即为粗提取酶液。取上清液分装，_20°C保存。可用于超氧化物歧化酶（S0D)、过氧化 物酶（P0D)、过氧化氢酶（CAT)和多酚氧化酶（ΡΡ0)活性的测定。
[0048] 1 ·超氧化物歧化酶（S0D)活性测定 超氧化物歧化酶S0D作为生物自由基的清除剂，具有清除逆境胁迫时体内过量的超氧 化物自由基，维持活性氧代谢平衡的功能，在植物-病原物相互作用过程中，参与了植物的 抗病反应，起着非常重要的作用。
[0049] 采用黄嘌呤氧化酶法测定转基因植株和非转基因植株在接种烟草疫霉菌后的超 氧化物歧化酶S0D的活力，具体方法参照南京建成生物技术公司S0D试剂盒进行。以每克 鲜样中S0D抑制率达50%时所对应的S0D量为一个酶活单位（U)。按如下公式计算：
在整个烟草疫霉菌侵染过程中，转基因剑麻和非转基因剑麻超氧化物歧化酶S0D酶活 性呈下降趋势，两者无显著差异。结果如图3c。
[0050] 2.过氧化物（POD)活性测定 采用愈创木酚法测定转基因植株和非转基因植株在接种烟草疫霉菌后的过氧化物P0D的活力。酶的反应体系包括2. 9 mL0.0 5mol/L磷酸缓冲液，L 0mLH202(2%)，L OmL0.0 5mol/ L愈创木酚和0. lmL酶液，以加热煮沸5分钟的酶液做对照。反应体系加入酶液后，于37 °C 水浴保温15min，迅速放入冰浴并立即加入2 mL 20%三氯乙酸终止反应，以酶的比活力表 示其活性变化。按如下公式计算： 过氧化物酶活（1]/^，111丨11)=(厶八470\￥1')八^^￥8\0.01\〇ΛA470 :反应时间内吸光度的变化；VT:提取酶液总体积；W:样品鲜重；Vs:测定时取 用酶液体积；t:反应时间。
[0051] 大量研究表明，过氧化物酶活性于植物的抗病性具有正相关关系。用病原菌接种， 抗病品种的过氧化物酶活性迅速升高，而与之相对照的感病品种的过氧化物酶活性或者没 有变化，或者活性升高的时间延迟。本发明中的剑麻转基因植株和非转基因植株，在接种烟 草疫霉菌24小时内，转基因植株和非转基因植株P0D酶活性急剧下降，然后在接种24小时 至72小时内，P0D酶活性迅速增加，而且转基因植株比非转基因植株P0D酶活性明显增加 快，增加的幅度大。即转基因剑麻植株比非转基因剑麻植株抗烟草疫霉菌的能力强。结果 如图3b。
[0052] 3.过氧化氢（CAT)活性测定 采用比色法测定转基因植株和非转基因植株在接种烟草疫霉菌后的过氧化氢CAT活 性。3mL反应液包括1. 0mL0. 2% H202,0. 05mL酶液和1. 95mL蒸馏水，在240nm处测定0D值 变化，以0D240每分钟减少0. 1为一个酶活性单位（U)。每15秒测0D值。按如下公式计 算： 过氧化氢酶活〇]/^，11^11)=(厶八240\￥1')八^^￥8\0.01\〇 VT:提取酶液总体积；W:样品鲜重；vs:测定时取用酶液体积；t:反应时间。
[0053] 过氧化氢CAT是生物氧化过程中重要的抗氧化酶，能有效地清除各种活性氧基 团，防止这些基因对细胞膜系统的损坏，在植物抗病过程中起着非常重要的作用。在整个接 种烟草疫霉菌过程中，转基因剑麻和非转基因剑麻过氧化氢CAT活性呈上升趋势，而且转 基因剑麻过氧化氢CAT活性比非转基因剑麻强，从而间接地提高了转基因剑麻抗烟草疫霉 囷的能力。结果如图3a。
[0054] 4.多酚氧化酶ΡΡ0活性测定 采用邻苯二酚法测定转基因植株和非转基因植株在接种烟草疫霉菌后的多酚氧化酶ΡΡ0活性。反应体系为：〇· 〇5mol/L磷酸缓冲液2. 9mL，0.lmol/L儿茶酚（0· 55儿茶酚加缓 冲液至50mL)lmL，酶液0.lmL，反应体系中加入酶液后立即于30°C保温lOmin，保温后迅 速放入冰浴，立即加入2mL20%的三氯乙酸TCA终止反应。测398nm或525nm下0D值，以 Λ0D398nm/g.Fw.min表不酶活性。按如下公式计算：0D398nm(g.fr.w.cm.min)=0D398XN/ (WXTXnXD) 其中，N为酶初提取液总体积mL;W为样品鲜重g;T为反应时间min，n为反应液所用酶 初提取液体积（mL)，D为比色皿直径（cm)。
[0055] 多酚氧化酶ΡΡ0参与植物体内酚类物质氧化产生醌类化合物和木质素形成，以杀 死和抑制病原菌的繁殖而起到抗病作用。在整个烟草疫霉菌侵染过程中，转基因剑麻多酚 氧化酶ΡΡ0活性迅速升高，且比非转基因剑麻升高显著，非转基因剑麻ΡΡ0活性略有增加， 但递增不显著。从而间接地说明通过转基因技术提高了剑麻对烟草疫霉菌的抗性。图3d。
【主权项】
1. 一种提高剑麻斑马纹病抗性的方法，其特征在于：包括如下步骤： (1) 橡胶素类多肽蛋白酶基因AFP1和AFP2的克隆 以牵牛花成熟种子为材料，采用改良Trizol法提取总RNA，经Ferments公司反转录试 剂盒合成第一链cDNA后，采用RT-PCR的方法克隆AFP1和AFP2基因，AFP1和AFP2基因全 长分别为279bp和276bp，编码92个氨基酸和91个氨基酸，AFP1和AFP2同源性高达95% 以上，均含有41个氨基酸的小分子信号肽； (2) 植物表达载体构建 设计带酶切位点的引物，以第一链cDNA为模板，通过PCR扩增目的基因AFP1和AFP2， 通过定向酶切与载体PISV2678连接，并电击转化农杆菌EHA105,构建含有目的基因AFP1和 AFP2的植物表达载体； (3) 农杆菌介导法转化剑麻 以剑麻H. 11648愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导法浸染愈伤组织，然后将浸染 后的愈伤组织接种在含有卡那霉素kan+和除草剂Basta的不定芽诱导培养基上诱导不定 芽，待不定芽长到4-6厘米高时，转入生根培养基上进行生根，待再生植株长出4-5条壮根 时，移植到基质为椰糠和河沙的塑料遮光大棚中继续培育； 愈伤组织诱导培养基为：MS基本培养基+0. 1-1. Omg/L萘乙酸NAA+1. 0-3. 5mg/L 6-苄 氨基腺嘌呤6-BA，不定芽诱导培养基为：SH基本培养基+1. 0-5. 0 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤 6-BA+0-1.5 mg/L萘乙酸NAA+0-1.5 mg/L吲哚3丁酸IBA+ 200mg/L卡那霉素kan++ 250 除草剂Basta，生根培养基为添加200 mg/L羧苄霉素的MS基本培养基； (4) 剑麻转化植株的鉴定 取1克转基因植株叶片提取基因组DNA，以DNA为模板，以AFP-F和AFP-R为引物，以非 转基因植株为阴性对照，经PCR检测后发现基因AFP1和AFP2已经成功转入剑麻； 引物AFP-F:5' -CACAACAGTGTGGGAGTCAAGCC-3' ； 引物AFP-R:5'-CGGTTGATTGGTTTGCAGTGGTAG-3'； (5) 剑麻转化植株抗病性检测 采用叶面针刺法活体和离体接种烟草疫霉菌，48小时候后观察病斑扩展情况，发现转 基因植株叶片病斑明显比非转基因植株小； (6) 剑麻转基因植株重要防御酶活性测定 采用叶面针刺法活体接种烟草疫霉菌，在接种0小时、24小时、48小时和72小时分别 测定转基因和非转基因植株超氧化物歧化酶S0D、过氧化物酶P0D、过氧化氢酶CAT和多酚 氧化酶PP0的活性，发现转基因植株参与活性氧清除的过氧化物酶POD和过氧化氢酶CAT 的活性，参与酚类化合物和木质素合成的多酚氧化酶PP0的活性明显比非转基因植株高。2. 根据权利要求1所述一种提高剑麻斑马纹病抗性的方法，其特征在于：步骤（3)所述 培养基的pH为5. 8-6. 0 ;光照12-14h，黑暗10-12h，光照强度为2000Lux，温度28±2°C。3. 根据权利要求1所述一种提高剑麻斑马纹病抗性的方法，其特征在于：步骤（3)所述 椰糠和河沙的质量比为1:1。
【专利摘要】本发明涉及一种提高剑麻斑马纹病抗性的方法，属于转基因技术领域；该方法首先基于已知基因序列设计特异性引物，克隆AFP1和AFP2目的基因，其全长分别为279bp和276bp，编码92和91个氨基酸，均含有41个氨基酸的小分子信号肽，通过构建包含有AFP1和AFP2的植物表达载体pISV2678并转化剑麻H.11648愈伤组织，获得含有AFP1和AFP2的转基因剑麻植株；与非转基因剑麻相比，本发明转AFP1和AFP2基因剑麻在接种烟草疫霉菌后病斑明显变小，抗性明显增强，参与活性氧清除的过氧化物酶POD和过氧化氢酶CAT的活性，参与酚类化合物和木质素合成的多酚氧化酶PPO的活性明显比非转基因植株高。本发明为提高剑麻斑马纹病的抗性提供了一条新的有效途径。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/55, C12N15/82
【公开号】CN105349576
【申请号】CN201510942475
【发明人】张燕梅, 周文钊, 李俊峰, 陆军迎, 林映雪
【申请人】中国热带农业科学院南亚热带作物研究所
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月16日