抑制玉米ZmDAR1家族基因表达提高玉米籽粒产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物生物工程领域，涉及一种提高玉米籽粒产量的方法，尤其涉及一 种抑制玉米ZmDARI家族基因表达提高玉米籽粒产量的方法。
【背景技术】
[0002] 玉米是世界上分布最广泛的饲料和粮食作物之一，也是重要的工业原料，总产量 居世界第一，种植面积仅次于小麦和水稻而居第三位。提高玉米产量是玉米育种的永恒课 题。
[0003] 生物的表型是由基因型决定的，玉米产量取决于其遗传基础（基因）和环境条件 的共同作用。虽然已检测出一些固有产量基因（IntrinsicYieldGenes,IYGs)或QTL，但 它们的作用机制知之甚少。在大多数的情况下，人们还不知道这些基因或QTL是怎样促进 产量形成的。在模式植物拟南芥研究中，人们发现一些基因的突变或异常表达能够使叶、根 等器官变大，从而使生物量增多，展现出似乎有很好的应用前景。而在玉米等作物中，人们 更关注的是单位面积的产量提高。若基因的异常表达或突变使植株产生更多和更大的叶 片和花器官，同时伴随开花时间大大延迟和生长周期延长，则这些基因在作物育种中应用 价值不大。也有一些基因在过量表达或在突变的情况下能够诱导大叶或种子增大，而对植 株生育期和抗逆性影响不大，它们有可能在作物育种中有重要价值。由于固有产量基因参 与很多其相互关系仍不是很清楚的生理活动，大器官形成是否仅含有更多的细胞或细胞体 积也发生增大也需大量的研究，发掘固有产量基因仍是植物生物工程领域中富有挑战的领 域。另外，特定基因的生物学功能在很大程度上取决于遗传背景，一个基因的表达变化对复 杂性状如器官大小等的影响依赖于个体的基因型。物种不同，同源基因的功能往往有明显 差异，特别是基因家族的基因。在模式植物中验证的基因效应往往与遗传距离较远作物中 的同源基因的功能有明显不同，因同工基因的数量及分工有差异，基因调控机制不完全相 同。
[0004] 被子植物中，种子大小决定于胚、胚乳和母体组织的协调生长，几个在母体行使作 用控制种子大小的因子，如AUXINRESPONSEFACT0R2、APETALA2、KLUH和DA1已被鉴定出 来，然而控制种子大小的遗传学和分子生物学机制知之甚少。
[0005] DA1基因首先是由李云海等（2008)在拟南芥中发现的。拟南芥中DA1基因家族控 制种子和器官的最终大小。DA1基因家族是植物特异的，在拟南芥中有7个蛋白的氨基酸序 列与DA1蛋白氨基酸序列相似，它们被命名为DAR蛋白，其中有4个蛋白的基因在5号染色 体上集族。DA1等位基因的功能缺失没有广生明显表型，推测DA1有可能与DAR蛋白共同发 挥作用。推测DA1与DAR蛋白共同发挥作用来控制器官发育。
[0006] DA1基因产物编码一种包含532个氨基酸的泛素受体，该泛素受体包含两 个UIM结构域（ubiquitininiteractionmotifs)和一个能够与锌指蛋白结合的 UM(Lin-ll，Isl-l，Mec-3三种转录因子首字母的缩写）结构域。此蛋白在植物中广泛存 在，在动物中尚未发现同源蛋白。DA1能够通过限制细胞增殖进而调控植物种子和器官大 小。DA1受ΑΒΑ诱导，而其他激素如茉莉酸、生长素，细胞分裂素等不影响其表达。当DAI氨基酸序列358位上的精氨酸（R)突变为赖氨酸（K)时，突变蛋白可能影响DA1和DARI 对底物的结合，进而以剂量依赖方式干扰DA1与DAR蛋白的功能，进而产生dal-1表型， 该突变体植株的种子、器官体积相对于野生型大幅增加，其植株整体生物量也有所增加。 Garcia(2005)和Schruff(2006)的研究表明，dal-Ι突变体中种子增大的现象是由于胚珠 中珠被增大引起的。dal-Ι植株花变大，且包含更多花瓣和心皮，荚果变短，皱褶呈扁平状， 叶片圆厚，莲杆增粗。并且，植株整体生物量亦有所增加。而不管花粉供体的基因型如何， dal-Ι产生的种子较野生型种子要大；而当突变体花粉授粉到野生型植株后所产生的种子 变化不明显，提示DA1能通过母本来控制种子的生物量。拟南芥DA1通过限制细胞增生时 期决定种子和器官的最终大小。dal-Ι编码的突变蛋白对DA1和一个DAl-related(DAR)蛋 白有负的作用，过表达dal-1cDNA相对于野生型强烈地增加了种子和器官大小。
[0007] 拟南芥中还存在另一个能够控制种子和器官大小的基因DA2,其产物具有E3泛素 连接酶活性，能够与DA1协同作用，共同调控细胞分裂。DA2编码具有E3泛素连接酶活性的 RING-type蛋白，后者控制发育种子的母体组织珠被的细胞增生。DA2突变体da2-l产生大 种子，而野生型中过表达DA2降低种子大小。过表达水稻中DA2的同源基因GRAINWIDTH ANDWEIGHT2,限制了拟南芥种子生长。泛素受体DA1通过和E3泛素连接酶DA2和DA1的 增强子1 (E0D1)/BIGBROTHER协同作用限制拟南芥种子生长。遗传学分析表明，DA2在功能 上与DA1协同调节种子大小，且不依赖于E0D1。DA2在体外和体内均与DA1相互作用。DA1 与DA1增强子1 (E0D1)/BIGBROTHER，一个E3泛素连接酶协同作用调节拟南芥种子大小。
[0008] 2014年李云海等报道，拟南芥中泛素受体DA1通过特异的调节泛素特异的蛋白酶 UBP15/S0D2的稳定性来调节种子和器官的大小。由SUPPRESS0R2OFDA1(S0D2)编码的 UBIQUITIN-SPECIFICPR0TEASE15 (UBP15)通过促进母体器官胚珠的珠被和正发育种子的 细胞增殖来调节细胞分裂。sod2/ubpl5突变体形成了小籽粒，在野生型中过表达UBP15增 加了种子大小。遗传学分析显示，UBP15和DA1在影响种子大小方面是在同一途径中行使 拮抗功能的，且不依赖于DA2和E0D1。无论在体内还是在体外，DA1与UBP15的物理作用调 节UBP15的稳定性。因此，这些发现建立了一个通过四种泛素关联蛋白DA1、DA2、E0D1和 UBP15来调节种子大小的遗传和分子网络，提示它们是增加作物籽粒大小的靶点。
[0009] 2015年，李云海等报道了拟南芥泛素受体DAUDAR1和DAR2通过调节TCP14/15的 稳定性冗余调节着细胞内加倍。细胞内加倍对应于细胞分化的起始，对应于细胞和器官大 小，但它们之间的关系知之甚少。DA1和它密切的家庭成员DAR1和DAR2在叶片发育过程 中是细胞内加倍所需的，但它们的作用呈现出冗余。DA1，DAR1、DAR2同转录因子TCP14和 TCP15的直接作用调节细胞周期基因的表达，抑制了细胞内加倍。在拟南芥中DA1，DAR1、 DAR2调节TCP14和TCP15蛋白的稳定性。遗传学分析表明DA1，DARI和DAR2与TCP14和 TCP15在同一通路上起作用，共同调控细胞内加倍过程。
[0010] 2015年，He等报道在豆类植物进化中DAl-like家族基因序列和表达水平发生 变化，提示在植株适应分布中有一定作用。栽培大豆被认为是从一年生的野生大豆驯化产 生，比较栽培大豆和野生大豆的DAl-like基因的序列和表达水平可以明确DAl-like基因 是否参与了豆科植物的进化。结果表明在栽培大豆和野生大豆之间，DAl-like基因之间 对应序列的一致性是相当高的，而在同一物种中横向同源基因之间表现出相对较高的多样 性。在发育和对非生物胁迫响应中，栽培大豆和野生大豆的DAl-like基因表达变化在不同 种的同源基因之间的差异程度显著大于同一物种中的同源基因之间。过表达野生种DA1基 因不影响种子大小，而过表达DA1基因减轻了转基因拟南芥种子萌发对盐胁迫的敏感性。 DAl-like家族的大多数基因能够提高转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性。这些结果提示豆类 植物DAl-like基因的表达多样化与豆类植物的适应性变化相关联，植物特异的DA1家族基 因表达增强会许在大豆对复杂环境的适应起作用。该工作表明，DAl-like家族基因具有功 能多样性。
[0011] 吴忠义课题组人工合成了与拟南芥DA1同源的基因玉米ZmDAl，同时引入 dal-l(DAlR358K)的突变碱基，产生Zmdal-1。将后者重组到植物表达载体中通过花粉管通 道法转入玉米，获得了转基因低水平表达的转基因植株。与转空载体的转化植株相比，转 Zmdal-1基因植株种子质量平均增加了 33.6%，收获产量增加了 23. 6%~114. 1%(Wang etal. ,2012) 〇
[0012] 综合本领域的研究现状，可得出在不同物种中DAl-like家族基因的功能可能有 明显不同；除拟南芥外，DA1家族基因的功能知之不多，更不清楚ZmDARl基因ZmDAR2基因 和ZmDAl基因在玉米中的确切作用，而通过抑制玉米ZmDARl家族基因表达提高玉米籽粒产 量的方法未见报道。
【发明内容】
[0013] 针对现有技术，本发明的目的是提供一种通过抑制玉米ZmDARl家族基因表达提 高玉米籽粒产量的方法。
[0014] 本发明所述抑制玉米ZmDARl家族基因表达提高玉米籽粒产量的方法，其特征在 于：利用转基因技术通过过表达突变基因ZmDARlm抑制玉米ZmDARl家族基因ZmDARl功 能，采用RNAi技术和转反义基因技术通过转入ZmDARl反义基因或ZmDARIRNAi结构或 ZmDAR2RNAi降低ZmDARl基因表达水平，获得籽粒产量明显高于未转基因自交系的转基因 玉米株系，实现提高玉米籽粒产量；其中，所述玉米ZmDARl家族基因ZmDARl的核苷酸序列 如SEQ ID No. 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，所述突变基因ZmDARlm为 第322氨基酸由精氨酸变为赖氨酸的ZmDARl突变蛋白的基因，该基因编码的氨基酸序列如 SEQ ID No. 5所示，所述ZmDARIRNAi结构由SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列5'端376个 核苷酸片段构建而成。
[0015] 申请人通过玉米基因组序列分析发现：在玉米基因组中存在着DAl-like家族基 因，其中GRMZM2G017845 为AtDAl的同源基因，位于玉米Chr6:52, 741，517-52, 749, 994。其 cDNA全长2883bp，编码509个氨基酸，多肽链333位为精氨酸（R)，氨基酸相似性为73 %。对 其进行保守结构域分析，得出与拟南芥DA1相似性高，同样包含2个ΙΠΜ结构域和UM结构 域，命名为ZmDAl基因。在玉米基因组中，还存在6个DAR(DA1related)基因：GRMZM2G0993 28 (chrl: 167, 000, 860-167, 006, 501)、GRMZM2G009438 (Chr4:192, 646, 789-192, 651，389)、 GRMZM2G151934 (chr9: 140, 212, 757-140, 21