专利名称：适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品制备方法
技术领域：
本发明属农田害虫防控技术领域，具体涉及一种适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品制备方法。
背景技术：
亚洲玉米螟又称钻心虫，属鳞翅目螟蛾科，是玉米的主要虫害，也为害高粱和谷子等作物。玉米螟可危害玉米植株地上的各个部位，使受害部分丧失功能，降低籽粒产量。北方春玉米区因玉米螟为害，一般年份减产10 %左右，大发生年减产20 % 30%。仅吉林省每年因玉米螟为害损失在5亿公斤以上。随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代，蛋白质组学的研究是生命科学进入后基因时代的特征，要对生命的复杂活动有全面和深入的认 识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究，可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心，样品制备和溶解事关2-DE的成效，目标是尽可能提高分辨率。由于昆虫血淋巴是血液和淋巴液的混合物，在昆虫的开放式循环系统中循环，是昆虫代谢的重要场所，也是代谢过程中各种物质储存和交换的场所，在昆虫的防御、抗冻、免疫、损伤应答等方面起重要作用。昆虫蛋白制备方法较多，但是针对亚洲玉米螟幼虫血浆样品(特别是适于双向电泳分析的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品)的制备方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于双向电泳的具有较高质量的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品制备方法。本发明包括下列步骤I.用75%酒精对亚洲玉米螟幼虫进行体表消毒，在_20°C冰冻IOmin ；2.取出亚洲玉米螟幼虫，在不挤压腹部不破坏消化道的前提下，用无菌剪剪掉幼虫腹足，再用IOul的移液枪吸取透明的血淋巴，在冰上快速将其放入离心管中，快速放入是为防止血淋巴被氧化；3.将吸取后的亚洲玉米螟放入底部设有小孔的O. 5ml的锥形离心管，再将锥形离心管插入I. 5ml离心管中，在4°C条件下8000Xg离心IOmin后，从I. 5ml离心管底部收集血淋巴，每200ul血淋巴中加入IOmgN-苯基硫脲；4.将收集好的血淋巴在4°C条件下5000\8离心51^11，取上清，按每管20111分装，每管中加入80ul 50%的PEG，使PEG的终浓度为40%，震荡混匀30s，放冰上冰浴Ih ；5.在4°C条件下15000Xg离心15min,弃上清,每管沉淀中加入600ull00%的冷丙酮悬浮震荡混匀，放冰上冰浴30min ；
6.在4°C条件下15000Xg离心15min,弃上清,每管沉淀中加入600ul 80%冷丙酮悬浮震荡混勻，放冰上冰浴30min,在4°C条件下15000 Xg离心15min,真空离心干燥Imin,得到亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白的粗提物；7.将亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白粗提物与水化/裂解缓冲液混合，在30°C条件下水浴30min，促进蛋白的溶解，然后在4°C条件下15000 X g离心5min，收集上清液，即得到适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品液。步骤6和7中所述的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白粗提物与水化/裂解缓冲液的质量体积比为 IOOmg / 100uL-300mg / IOOuL。步骤7中所述的水化/裂解缓冲液为含有5mol / L尿素、2mol / L硫脲、2%CHAPS,20mM 二硫苏糖醇、O. 002%溴酚蓝和2% IPG缓冲液的溶液。本发明采用PEG法提取蛋白，避免了血糖、血脂、有机酸、色素等干扰物质对双向 电泳的影响。本发明的方法水化/裂解缓冲液中的尿素可以使蛋白质去折叠暴露疏水核心，而配合使用硫脲会增加蛋白质在固定pH梯度(IPG)胶条中的溶解性；二硫苏糖醇还原二硫键，从而使蛋白质达到完全溶解的状态；IPG缓冲液能清除氰酸盐离子、离心时加速核酸沉淀。本发明的适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品的制备方法快速、简单易行，可获得高质量、重复性好的双向电泳图谱，便于进行后续生物质谱分析鉴定蛋白的研究，本发明可广泛应用于亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白质组学研究，具有较高的实用价值。
图I为亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品的双向电泳图谱其中丽为蛋白质分子量标准，单位是kDa。
具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；实施例中的浓度，如无特别说明，均为体积百分比(V / V)。实施例制备亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白双向电泳样品并进行双向电泳分析I)收集5龄亚洲玉米螟幼虫，用75%酒精对亚洲玉米螟幼虫进行体表消毒，然后放在无菌滤纸片上吸干酒精，将消毒后的幼虫在-20°C冰冻麻醉IOmin ；2)将幼虫取出，在不破坏消化道的前提下，用无菌剪剪掉幼虫腹足，挤压腹部，再用IOul的移液枪吸取透明的血淋巴，放入离心管中(注意速度要快，否则血淋巴容易氧化，并在冰上进行)；3)将吸取后的亚洲玉米螟放入底部设有5个小孔的O. 5ml的锥形离心管，再将锥形离心管插入I. 5ml离心管中，在4°C条件下8000Xg离心IOmin后，从I. 5ml离心管底部收集血淋巴，每200ul血淋巴中加入IOmgN-苯基硫脲；4)将收集好的血淋巴在4°C条件下5000\8离心51^11，取上清，按每管20111分装，每管中加入80ul 50%的PEG (聚乙二醇)，使PEG的终浓度为40%，震荡混匀30s，放在冰上冰浴Ih ；5)在4°C条件下15000Xg离心15min,弃上清,每管沉淀中加入600ull00%的冷丙酮悬浮震荡混匀，放在冰上冰浴30min ；6)在4°C条件下15000Xg离心15min,弃上清,每管沉淀中加入600ul 80%冷丙酮悬浮震荡混勻，放在冰上冰浴30min,在4°C条件下15000 Xg离心15min,真空离心干燥Imin,得到亚洲玉米螟幼虫血衆蛋白的粗提物；7)将亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白粗提物与水化/裂解缓冲液混合，在30°C条件下水浴30min，然后在4°C条件下15000 Xg离心5min，收集取上清，即得到适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品液，所述的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白粗提物与水化/裂解缓冲液的质量体积比为IOOmg / 100uL-300mg / IOOuL0
所述水化/裂解缓冲液为含有5mol / L尿素、2mol / L硫脲、2 %CHAPS (3- [3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonic acid)、20mM 二硫苏糖醇(DTT)、0. 002%溴酚蓝和2% IPG缓冲液的溶液；8)加入蛋白粗提物的水化/裂解缓冲液的溶液放入水浴锅中，水浴温度为30°C，时间为30min，4°C条件下15000 X g离心取上清，即为用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆
蛋白样品；9)通过上述过程提取的蛋白，用Bradford法紫外分光光度计测定蛋白浓度，结果表明上述得到的双向电泳亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品中蛋白浓度为2-4ug / uL。按照如下方法进行双向电泳利用Ettan IPGphor III soelectric FocusingSyStem(通用电气医疗集团，USA)在20°C进行第一向等电聚焦电泳(IEF)。电泳条件为500V电泳Ih,随后1000V电泳lh，4000V电泳lh，最后8000V达到总伏时数为40000Vh。然后将聚焦后的固定PH梯度胶条(IPG胶条)在IOmL平衡缓冲液l(50mmol / L Tris-Cl缓冲液，pH8. 8 ；6mol / Lurea ;30%甘油，0. 02g / mL SDS,0. Olg / mL 二硫苏糖醇)中平衡 15min,然后在 IOml 平衡缓冲液 2 (50mmol / L Tris-Cl 缓冲液,pH8. 8 ；6mol / L urea ；30%甘油，0. 02g / mL SDS’0. 25g / mL碘乙酰胺)中平衡15min。将平衡后的胶条转移到第二向凝胶上，第二向电泳利用EttanDALTsix system(通用电气医疗集团，USA)在12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行(平均每块凝胶30mA恒流电泳，溴酚蓝指示剂跑出凝胶时电泳结束)。凝胶采用硝酸银染色法，结果如图I所示，结果表明亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品分离效果较好，没有发生明显的蛋白降解。
权利要求
1.一种适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品制备方法，其特征在于包括下列步骤 1)用75%酒精对亚洲玉米螟幼虫进行体表消毒，在-20°c冰冻IOmin； 2)取出亚洲玉米螟幼虫，在不破坏消化道的前提下，用无菌剪剪掉幼虫腹足，挤压腹部，再用IOul的移液枪吸取透明的血淋巴，在冰上快速将其放入离心管中； 3)将吸取后的亚洲玉米螟放入底部设有小孔的O.5ml的锥形离心管，再将锥形离心管插入I. 5ml离心管中，在4°C条件下8000Xg离心IOmin后，从I. 5ml离心管底部收集血淋巴，每200ul血淋巴中加入IOmgN-苯基硫脲； 4)将收集好的血淋巴在4°C条件下5000X g离心5min，取上清，按每管20ul分装，每管中加入80ul 50 %的PEG，使PEG的终浓度为40 %，震荡混匀30s，放冰上冰浴Ih ； 5)在4°C条件下15000Xg离心15min，弃上清，每管沉淀中加入600ull00%的冷丙酮悬浮震荡混匀，放冰上冰浴30min ； 6)在4°C条件下15000Xg离心15min,弃上清,每管沉淀中加入600ul 80 %冷丙酮悬浮震荡混勻，放冰上冰浴30min,在4°C条件下15000 Xg离心15min,真空离心干燥Imin,得到亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白的粗提物； 7)将亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白粗提物与水化/裂解缓冲液混合，在30°C条件下水浴30min,促进蛋白的溶解，然后在4°C条件下15000 X g离心5min，收集上清液，即得到适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品液。
2.按权利要求I所述的适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品制备方法，其特征在于所述的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白粗提物与水化/裂解缓冲液的质量体积比为IOOmg / 100uL-300mg / IOOuL0
3.按权利要求I所述的适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品制备方法，其特征在于所述的水化/裂解缓冲液为含有5mol / L尿素、2mol / L硫脲、2 % CHAPS、20mM二硫苏糖醇、O. 002%溴酚蓝和2% IPG缓冲液的溶液。
全文摘要
适用于双向电泳的亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品制备方法属农田害虫防控技术领域，本发明包括将亚洲玉米螟幼虫体表消毒，收集血淋巴，每200ul血淋巴中加入10mgN-苯基硫脲；将血淋巴离心取上清分装，每管中加入80ul 50％的PEG，终浓度为40％，震荡混匀，冰浴1h；离心弃上清，沉淀中加入4倍体积冷丙酮悬浮震荡混匀，冰浴30min；将亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白粗提物溶解于水化／裂解缓冲液后，离心取上清液，得到亚洲玉米螟幼虫蛋白双向电泳样品液。采用本发明制备亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白样品快速、简易，且可获得高质量、重复性好的双向电泳图谱，便于进行后续生物质谱分析鉴定蛋白的研究，本发明可广泛应用于亚洲玉米螟幼虫血浆蛋白质组学研究，具有较高的实用价值。
文档编号G01N1/28GK102928278SQ201210450768
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月12日 优先权日2012年11月12日
发明者张炬红, 王滔, 席景会, 王玉, 衣建坤, 孙宇, 张桦, 杨巽 申请人:吉林大学