预测肾细胞癌的预后的方法

预测肾细胞癌的预后的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及包含检测DNA甲基化水平的用于检测肾细胞癌预后不良风险的方法。 而且，本发明还涉及用于该方法的寡核苷酸。
【背景技术】
[0002] 肾细胞癌（RCC)经常会发生在属于劳动力的壮年期，一方面有很多病例通过肾切 除术而根治，然而迅速引起远处转移的病例也明显存在，两组病例在临床过程有很大差异。 此外，即使发生转移，免疫疗法和分子靶向治疗药物等有效的病例是公知的。如果对复发可 能性高的病例密切观察，早期诊断复发，追加后期治疗，有可能能够改善预后。然而，即使是 属于组织病理学异型性低、组织学类型最常见的透明细胞型RCC，也有造成急速远处转移的 病例，根据现有的临床病理因子等预测预后是困难的。
[0003] 公知透明细胞型RCC的特征在于VHL肿瘤抑制基因的失活。此外，RCC系统性的再 测序和外显子分析在癌基因组图谱计划，癌基因组计划以及其它的国际策略中实施。而且， 通过这样的策略，已经阐明作为组蛋白H3赖氨酸36甲基转移酶的SETD2,作为组蛋白H3赖 氨酸4去甲基化酶的JARID1C (KDM5C)，作为组蛋白H3赖氨酸27去甲基化酶的UTX (KDM6A)， 作为SWI/SNF染色质重塑因子的PBRMl等的组蛋白修饰基因的失活参与肾细胞癌的发生 (非专利文献1~3)。另外，也报道了在RCC中的NF2基因的非同义突变和MLL2基因的缺 失突变（非专利文献1)。然而，这些基因突变并不能完全解释上述RCC中的临床过程的差 异等（临床病理学的多样性）。
[0004] 在癌症的发生过程中，不仅认识到遗传现象，也认识到外遗传现象，这两种现象在 各种组织中彼此相关而导致临床病理学的多样性。此外，认为DNA甲基化的改变是人类癌 症中主要的外遗传变化之一。
[0005] 实际上，对于RCC，本发明者们根据基于甲基化特异性PCR(MSP)，C0BRA(组合使用 亚硫酸氢盐和限制性酶的分析）以及细菌人工染色体（BAC)阵列的甲基化CpG岛的扩增方 法（BAMCA方法），通过分析，已经发现从RCC患者获得的非癌肾皮质组织表现出与DNA甲基 化状态的改变相关的癌前阶段（专利文献1和非专利文献4-7)。此外，根据BAMCA法的全 基因组分析，表明在癌前阶段中非癌肾皮质组织的DNA甲基化的改变，也延续到同一患者 相应的RCC中，已成功地开发了用于预测RCC病例预后的方法（专利文献1和非专利文献 6) 〇
[0006] 然而，通过BAMCA方法评价DNA甲基化状态的技术是复杂的，而且，在通过所述 BAMCA方法预测RCC病例的预后的情况中，由于发明当时BAC克隆可覆盖的染色体区域非常 有限，并没有真正鉴定到诊断能力高的甲基化CpG位点。
[0007] 另外，已经明确了癌症与DNA甲基化相关，在大肠癌和胃癌等中，存在以下癌症性 状：积累与病例临床病理因子相关的CpG岛的DNA甲基化的增强（CHMP)(非专利文献8~ 11) 〇
[0008] 然而，对于肾细胞癌，认为CIMP阳性性状和肾细胞癌的关联并不明确（非专利文 献12)。事实上，各肿瘤中甲基化CpG的数目表现出不同于预期的泊松分布的分布，虽然基 于该发现，推定一部分的肾细胞癌表现出CIMP的可能性，但是，在肾脏中，并没有确定CIMP 阳性肾细胞癌的存在，也没有鉴定出特征性的明确的CpG位点（非专利文献13)。
[0009] 由于所述状况，对于肾细胞癌，虽然一直期待表明肾细胞癌中存在与RCC临床病 理因子强烈相关的CpG岛中DNA甲基化积累的特征（CHMP)，鉴定成为(ΠΜΡ标志物的CpG位 点，获得能够方便且高灵敏度和高特异性地预测RCC预后的方法，但是现状是这些都还没 有实用化。
[0010] 现有技术
[0011] 专利文献
[0012] 专利文献1:特开2010-63413号公报
[0013] 非专利文献
[0014] 非专利文献 l:Dalgliesh G. L.等人，Nature，2010 年 463 卷，第 360-363 页
[0015] 非专利文献 2: Van Haaften G.等人，Nat. Genet.，2009 年第 41 卷，第 521-523 页
[0016] 非专利文献 3:Varella I.等人，Nature，2011 年第 469 卷，第 539-542 页
[0017] 非专利文献 4:Arai E.等人，Clin. Cancer Res.，2008 年第 14 卷，第 5531-5539 页
[0018] 非专利文献 5:Arai E.等人，Int J Cancer，2006 年第 119 卷，第 288-296 页
[0019] 非专利文献 6: Arai E.等人，Carcinogenesis，2009 年第 30 卷，第 214-221 页
[0020] 非专利文献 7:Arai E.等人，Pathobiology，2011 年第 78 卷，第 1-9 页
[0021] 非专利文献 8: Issa J.P.，Nat. Rev. Cancer，2004 年第 4 卷，第 988-993 页
[0022] 非专利文献 9: Toyota M.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1999 年第 96 卷，第 8681-8686 页
[0023] 非专利文献 KhShen L 等人，Proc Natl Acad Sci USA，2007 年第 104 卷，第 18654-18659 页
[0024] 非专利文献 11: Toyota M.等人，Cancer Res.，1999 年第 59 卷，第 5438-5442 页
[0025] 非专利文献 12:Morris，M. R.等人，Genome Med.，2010 年 2(9) :59
[0026] 非专利文献13:]^1?〇1^1(1^.等人，]\1〇1.031?^1，2009 年8:31
[0027] 发明概述
[0028] 发明所要解决的课题
[0029] 本发明的目的是提供一种方便且高灵敏度和高特异性的用于确定肾细胞癌预后 不良的风险的方法。
[0030] 解决课题的手段
[0031] 为了达到上述目的，本发明者们采用1个CpG分辨率的Infinium阵列，对29个正 常肾皮质组织（C)样本，透明细胞型肾细胞癌（透明细胞RCC)患者获得的107个非癌肾皮 质组织（N)样本和109个癌组织（T)样本，进行了甲基化组（methylome)分析。其结果表 明，样本N的DNA甲基化水平与样本C比较，在4830个CpG位点已经发生了改变。另外，鉴 定了 801个CpG位点，这些位点在样本N中产生DNA甲基化的改变，而且在样本T中这些改 变继续增强，根据在这801个CpG位点上的DNA甲基化水平，进行了无监督层次聚类分析。 其结果发现肾细胞癌可分为集群A(n = 90)和集群B(14例）。而且，在该集群B中，聚集 了临床病理学上恶性度高的肿瘤，而且，发现属于该集群B的患者的无癌存活率（无复发存 活率）和总体存活率（总存活率）与属于集群A的患者相比显著降低。即，明确了属于集 群B的肾细胞癌具有基于CpG岛中DNA高度甲基化的积累所带来的特征，是CpG岛甲基化 性状（CIMP)阳性的癌症。
[0032] 此外，也第一次发现 FAM150A，GRM6, ZNF540, ZFP42, ZNF154, R頂S4, PCDHAC1， KHDRBS2, ASCL2, KCNQl，PRAC，WNT3A，TRH，FAM78A，ZNF671，SLC13A5 以及 NKX6-2 基因的 CpG 位点中DNA高度甲基化是肾细胞癌中(ΠΜΡ的特征。
[0033] 另外，专利文献1和非专利文献6所表明的，通过检查DNA甲基化的有无，鉴定的 有效预测肾细胞癌预后的与肾细胞癌相关的区域（70个BAC克隆）中，不包含本发明鉴定 的17个基因的CpG位点的任一个。
[0034] 而且，还确认了可以使用除Infinium阵列（使用焦磷酸测序法和质谱仪的DNA甲 基化分析法）分析以外的方法检测这17个基因的CpG位点中高度甲基化状态，并完成了本 发明。更具体地，本发明如下所述。
[0035] 〈1> 一种检测肾细胞癌的预后不良风险的方法，其包括以下（a)~（c)的步骤
[0036] (a)制备来自受试者肾脏组织的基因组DNA的步骤，
[0037] (b)检测步骤（a)制备的基因组DNA中基因的至少一个CpG位点的DNA甲基化水 平的步骤，所述基因选自以下基因组成的基因群：FAM150A，GRM6, ZNF540, ZFP42, ZNF154， R頂S4, PCDHAC1，KHDRBS2, ASCL2, KCNQ1，PRAC，WNT3A，TRH，FAM78A，ZNF671，SLC13A5 和 NKX6-2，
[0038] (c)根据步骤（b)检测到的DNA甲基化水平，确定所述受试者是否分类为预后不良 组的步骤。
[0039] 〈2>根据〈1>所述的方法，其中步骤（b)是通过亚硫酸氢盐处理步骤（a)制备的基 因组DNA，检测所述CpG位点的DNA甲基化水平的步骤。
[0040] 〈3> -种用于〈1>或〈2>所述方法中的寡核苷酸，其具有至少12个碱基的链长度， 所述寡核苷酸为下述（a)~（b)中记载的任一个
[0041] (a)寡核苷酸，所述寡核苷酸是设计成夹着选自上述基因群的基因的至少一个 CpG位点的一对引物，
[0042] (b)寡核苷酸，所述寡核苷酸是与含有选自上述基因群的基因的至少一个CpG位 点的核苷酸杂交的引物或探针。
[0043] 发明的效果
[0044] 能够方便且尚灵敏度和尚特异性地确定肾细胞癌预后不良的风险。
[0045] 附图的简单说明
[0046] 图1是显示来自透明细胞型肾细胞癌患者的非癌肾皮质组织（N)和肿瘤组织（T) 的组织学差异的显微镜照片。即，N主要由近端肾小管组成。另一方面，在T中观察到胞状 构造，而且，肿瘤细胞的细胞质中充满脂质和糖原，清晰地由细胞膜包围。此外，显微镜照片 显示肿瘤细胞的细胞核倾向呈圆形，伴有细粒状均匀分布的染色质。
[0047] 图2显示通过Infinium测试检测到的ZFP42基因 CpG位点相关的DNA甲基化水 平（β值）与通过焦磷酸测序检测到的ZFP42基因 CpG位点相关的DNA甲基化水平的相关 性的图。
[0048] 图3显示通过Infinium测试检测到的ZFP154基因 CpG位点相关的DNA甲基化水 平（β值）与通过焦磷酸测序检测到的ZFP154基因 CpG位点相关的DNA甲基化水平的相 关性的图。
[0049] 图4显示通过Infinium测试检测到的ZFF540基因 CpG位点相关的DNA甲基化水 平（β值）与通过焦磷酸测序检测到的ZFF540基因 CpG位点相关的DNA甲基化水平的相 关性的图。
[0050] 图5是显示能够通过无监督层次聚类分析，采用801个探针（CpG位点）测定的癌 组织⑴和非癌组织（N)间DNA甲基化水平的差值（Δ βΤΝ)进行细分群，将104例透明细 胞型肾细胞癌患者细分群为集群Α(η = 90)和集群Β(14例）的图。另外，采用上述801个 探针测定的DNA甲基化，在癌前阶段已经发生变化，可以认为其参与后继的肾细胞的癌变。
[0051] 图6是显示透明细胞型肾细胞癌患者（属于集群A的患者和属于集群B的患者） 术后无复发存活率的随时间变化的图。
[0052] 图7是显示透明细胞型肾细胞癌患者（属于集群A的患者和属于集群B的患者） 术后总存活率的随时间变化的图。
[0053] 图8是显示相对于Infinium测试检测对象的所有26454个探针，透明细胞型肾细 胞癌患者的非癌组织（样本Ν)和该患者的癌组织（样本Τ)之间的DNA甲基化水平的差 (Α 0^的绝对值）在0. 1以上的探针比率的图。在图中，"全部病例"表示分析的所有透 明细胞型肾细胞癌患者的结果，"Α"表示分析的透明细胞型肾细胞癌患者中，属于集群A的 透明细胞型肾细胞癌患者，"Β"表示分析的透明细胞型肾细胞癌患者中，属于集群B的透明 细胞型肾细胞癌患者。棒表示SD (标准偏差），"NS"表示没有观察到显著差异（图9-12同 样如此表示）。
[0054] 图9是显示相对于Inf inium测试检测对象的所有26454个探针，样本N和样本T 之间的DNA甲基化水平的差（Δ 0^的绝对值）在0.2以上的探针比率的图。