从皱纹盘鲍鲍鱼内脏中分离的抗炎肽及其用图
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体地说生物活性肽领域。特别地，本发明涉及使用连续HPLC纯化系统从鲍鱼肠中分离的抗炎肽及其用途。
【背景技术】
[0002]炎症表示允许组织响应于损伤或感染的一组高度协调的事件，其需要各种细胞类型表达的参与和以顺序的方式对各种各样媒介物的反应(Sebban&Courtois，2006)。巨噬细胞是先天免疫系统中的主要免疫细胞。当被病原体感染时，巨噬细胞的活化在炎症响应中起着关键的作用。巨噬细胞可以通过吞噬作用直接地杀死病原体和通过分泌各种促炎症媒介物间接地杀死病原体。巨噬细胞在涉及促炎症细胞因子和炎症媒介物的生成过剩的炎性疾病中起着重要的作用，促炎症细胞因子包括白细胞介素(IL-li3)、IL_6和肿瘤坏死因子(TNF-α)，炎症媒介物包括由活化诱导型一氧化氮合酶(iNOS)生成的氧化物(NO) (Lee等人，2006;Walsh，Crotti，Goldring，&Gravallese，2005)。勵经由L-精氨酸的末端胍氮的氧化由NOS生成，且涉及炎症和致癌作用(Wong&Bi 11 iar，1995)。因此，通过阻断iNOS表达来抑制NO生成过剩可用于治疗各种炎性病症。
[0003]脂多糖(LPS)，是革兰氏阴性菌的主要成分，引起在炎症响应的发病机理中起到关键的作用的许多主要的细胞响应，且已被用于诱导巨噬细胞活化。在用LPS刺激之后，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)还调节关键的促炎症途径。MAPK(ERK 1/2，p38和JNK)是响应于各种阵列的细胞外刺激而被活化且介导从细胞表面到核的信号转导的一组丝氨酸/苏氨酸激酶(Cobb&Goldsmith，1995)。此外，MAPK先前已经涉及与LPS诱发的炎症相关联的信号通路。已经表明三种主要的MAPK的磷酸化和活化在LPS诱发的巨噬细胞中引起炎症基因表达(Hommes，Peppelenbosch，&van Deventer，2004)。LPS处理导致经由MAPK信号通路通过使p38、ERK和JNK磷酸化来调节iNOS的表达，p38、ERK和JNK是MAPK亚科的主要三个不同的组(Car1等人，2000)，被认为在炎性疾病中以不同的性能起着不同的作用。因此，MAPK的参与经常涉及疾病的发生和免疫或炎症响应的表达(Inoue&Kubo，2004)。
[0004]生物活性肽是对身体功能或状况具有积极影响且最终可能影响人类健康的特定蛋白片段;其预期由安全、可靠和一致的口服递送系统来提供。肠胃蛋白水解酶帮助在消化之后释放肽，且这些被吸收的组分部分对人来说足以是生理学上活性的。此外，也已报道了源自胃消化液的生物活性肽对抗炎、抗高血压、抗氧化、抗癌、抗菌和抗关节炎方面具有有益效果(Jung，Rajapakse，&Kim，2005; Rajapakse，Mendi s，Jung，Je，&Kim，2005; Ryu，Qian，&Kim，2010)。特别地，由于胃消化液肽为生产相当大量的生物活性肽提供了迅速和可再现的方法，胃消化液肽可成为营养制剂中潜在有益的成分(Kapsokefalou&Miller，1991)。
[0005]鲍鱼是海洋腹足动物，它们是亚洲、非洲、澳洲和美洲中大量海上养殖的重要渔业和食物工业资源之一。太平洋鲍鱼，即皱纹盘鲍，已经从二十世纪九十年代在东亚地区大量海上养殖。
[0006]海洋生物拥有具有许多营养和药物活性相关的生理功能的各种生物活性天然组分，所述生理功能例如抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、抗高血压、抗凝、抗心血管疾病等(Mayer，Rodriguez，Berlinck，&Fusetani，2011)。然而，虽然已经关于病理学、遗传学和水产养殖技术对鲍鱼的生物学性质和生理性质进行了许多研究，但很少报告鲍鱼对健康的有益影响(Sun等人，2OlO;Ekanayake等人，2008 ； Zoysa等人，2009 ； Wan，Whang，&Lee，2005)。
[0007]在本发明中，申请人公开了来自鲍鱼内脏蛋白中肽的纯化和表征，并检测了该肽对其通过诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达来抑制一氧化氮(NO)产生和减少巨噬细胞中促炎症细胞因子的基因转录的效果。这些事件与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活化一致。通过肽抑制该信号途径可以调节LPS诱发的炎症响应。
【发明内容】
[0008]最近，通过蛋白水解获得的生物活性肽由于其舒展结构、组成和序列的性质以及它们的生物学活性而受到大量关注。它们可用作生产人的营养制品和医药品的通用原材料。生物活性肽已经从包含高蛋白浓度的各种原材料中获得(Vo，Ryu，&Kim，2013; Harnedy&FitZGerald，2012)。因此，鲍鱼(皱纹盘鲍)被认为是用于生产生物活性肽例如抗炎肽的主要来源。利用体外模拟胃肠道消化-包括胃蛋白酶、胰蛋白酶和a-胰凝乳蛋白酶的胃肠肽链内切酶水解。据信先前用肽链内切酶水解可以增加活性肽的生物利用度并避免在胃肠道中进一步消化。先前的研究已经表明，与单酶消化相比，胃肠道酶消化导致更有效的肽(Vo，Ryu，&Kim，2013)。值得注意的是，具有低分子量的生物活性肽可能跨过肠屏障。大量研究已经证实，低分子量肽显示出有效的抗炎生物活性。Lee等人(2009)制备了具有1.3kDa以下的尺寸分布的蛋白肽，且这些肽减弱了炎性肠病的症状。来自极大螺旋藻(spirulinamaxima)的抗炎LDAVNR(683Da)和MMLDF(655Da)、来自长牡顿(Crassostrea gigas)的QCQCAVEGGL( 1007.28Da)、和来自菲律宾蛤仔(Ruditapes phiIippinarum)的QCQQAVQSAV204( 1061.32Da)，呈现出抗炎效应(Vo，Ryu，&Kim，2013 ;Hwang 等人，2012 ;Lee 等人，2012)。根据文献，抗炎肽具有宽范围的分子量。本发明者进行了大量的研究使用连续HPLC纯化系统从鲍鱼(皱纹盘鲍)肠中分离出抗炎肽AAIP(Pro-Phe-Asn-Glu-Gly-Thr-Phe-Ala_Ser，1175.2Da)，并发现其具有有效的抗炎效果。另一方面，本发明涉及该抗炎肽AAIP在抗炎疗法中的用途，以及作为功能性保健食品的应用。具体地，本发明还涉及该抗炎肽AAIP在制备用于治疗炎症的药物和保健性食品中的用途。
[0009 ] 具体地，本发明使用胃消化工艺(即Kapsokef al ou&Mi 11 er (1991)中描述的方法)，通过先后加入一定量的胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶在一定的温度和PH下进行水解。然后，通过UF膜生物反应器系统进行分级。随后通过离子交换色谱法和HPLC进行纯化。与现有技术利用酶解方法相比，本发明的使用胃肠道酶消化将会获得更有效的肽，本发明利用模拟胃肠道消化技术获得的活性肽应用于保健品比酶解获得的活性肽更容易跨过肠屏障，容易吸收，活性效果更佳。
【附图说明】
[0010]图1.来自AIGID III的抑制NO生成的肽的纯化。(A)通过Hiprep 16/10DEAE FF阴离子交换色谱法的AIGID III的快速蛋白液相色谱法(FPLC)，且使用20mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)中的2.0M NaCl的线性梯度溶液(0-100 % )，以2.4mL/min的流速进行洗脱。(B)使用FPLC在Hiprep 16/1ODEAE FF柱上各级分抑制NO生成的活性。误差棒表示在从原始值减去背景值之后来自三份实验的平均值和S.D。
[0011]图2.(A)Fr IV活性组分在Primesphere 1Ci8柱上的反相HPLC图，且HPLC操作使用15%乙腈作为流动相，以lmL/min的流速，使用UV探测器在215nm下进行。(B)在Primesphere10C18柱色谱上具有反相HPLC图的级分抑制NO生成的活性。误差棒表示在从原始值减去背景值之后来自三份实验的平均值和S.D13(C)将具有最高生成活性的活性级分峰通过最后在Synchropak RPP-100分析柱上纯化来进一步分离。HPLC操作使用10%乙腈作为流动相，以lmL/min的流速，使用UV探测器在215nm下进行。(D)AAIP的分子质量和氨基酸序列的识别。MS/MS实验在设置有纳米-ESI源的Q-TOF串联质谱仪(Micromass C0.,Manchester，UK)上进行。活性肽的测序在m/z范围50-2500内获得，并通过使用P印Seq de nove测序算法来测序。
[0012]图3.(A)AAIP对RAW 264.7细胞活力的细胞相容性影响。细胞用指定浓度(0_500μΜ)的AAIP处理。在AAIP处理24h之后，细胞活力通过如文本中所描述的MTT测定来评估。结果是三个独立实验的平均值土标准误差。(B)AAIP对RAW264.7细胞中LPS诱发的NO生成的影响。在不含血清的培养基中培养的细胞用不同浓度(10-500μΜ)的AAIP预处理lh，然后用LPS(100ng/mL)刺激。条件培养基在48h之后收集，且NO浓度使用格里斯反应测量。
[0013]图4.AAIP对RAW264.7细胞中LPS诱发的mRNA和iNOS蛋白表达的影响。在不含血清的培养基中培养的细胞用不同浓度(10_500μΜ)的AAIP预处理lh，且然后用LPS(100ng mL—1)刺激。提取细胞溶解产物，且分别通过RT-PCR和蛋白印迹分析iNOS的基因和蛋白水平。GATOH和β-肌动蛋白表达分别用作RT-PCR和蛋白印迹中基因和蛋白的内部对照。(A)提取细胞溶解产物，并通过RT-PCR分析基因(IL-Ιβ、TNF-a和IL-6 )0(B)提取细胞溶解产物，并分别通过蛋白印迹分析iNOS的蛋白水平。
[0014]图