(A))。合并每个级分，冻干，并测量其抑制NO生成的活性。级分IV显示出最高的抑制勵生成的活性(图1(8)，在1^￥264.7细胞中，以50(^/1^，78.6%)。将冻干的活性级分IV通过RP-HPLC，在Primesphere 10Cis(20mm X 250mm)柱上，使用包含0.I %三氟乙酸(TFA)的15%乙腈溶液进一步分离。将该级分分成三个澄清的级分FrIV-l、FrIV-2和FrIV-3(靶肽)(图2(A))。合并每个级分，冻干，并测量其抑制NO生成的活性JrlVK靶肽)显示出比其他级分更高的抑制NO生成的活性(图2(B)，在RAW264.7细胞系中，以200yg/mL，82.5% )。将FrIV-3 合并，并在 Synchropak RPP-100 分析柱(1mm X 250mm)上，使用包含
0.1 %TFA的10%乙腈溶液进一步纯化(图2(C))。纯化的肽的氨基酸序列被确定为Pro-Phe-Asn-Glu-Gly-Thr-Phe-Ala-Ser(靶肽，AAIP3; 1175.2Da，图2(D))。通过ESI/MS光谱学确定的质量与根据序列的理论质量极好地一致。
[0042]由此可知，本发明的从鲍鱼肠中分离的AAIP(Pro-Phe-Asn-Glu-Gly-Thr-Phe-Ala-Ser，1175.2Da)显示出有效的抗炎效果(图2)。
[0043]细胞活力和通过AAIP抑制NO的生成
[0044]AAIP对RAW 264.7细胞活力的细胞相容性影响。结果表明AAIP以10_500μΜ的不同浓度对这三种测试的培养细胞系不显示细胞毒性效应，如图3(A)所示的。用LPS(100ng/mL)刺激RAW264.7细胞显示与非刺激组相比显著增加的细胞亚硝酸盐(NO)水平。测试不同浓度的AAIP抑制该LPS刺激的NO生成的能力。NO是由LPS刺激的细胞所释放的NO的转化的稳定产物。如图3(B)所示的，AAIP具有抑制LPS刺激的RAW264.7细胞中NO生成的最高能力，且该抑制是剂量依赖性的(50-500μΜ)。
[0045]由AAIP通过抑制iNOS表达和抑制促炎症细胞因子来抑制NO生成
[0046]巨噬细胞是涉及炎症的主要细胞且它们负责炎症的主要功能，特别地通过生成各种细胞因子和生长因子来免疫调节$11」1￥3作&1((^35^811；[，2004)。炎症是复杂的生物学过程，其中巨噬细胞在开始、维持和溶解上起到关键的作用，包括促炎症细胞因子和炎症媒介物例如TNF-a、IL-lb、IL-6、N0和前列腺素(PGE2)的生成过剩(Kim&Moudgil，2008; Yoon等人，2009)。TNF-a和IL-1b是通过触发一连串炎症媒介物，比如血小板活化因子和白三烯、前列腺素、N0、IL-6和IL-8来介导急性和慢性炎症两者的促炎症细胞因子(Dinarello，2000)。体外和体内抑制TNF-a和IL-1b的生成已经广泛地应用于筛选抗炎剂(Yoon等人，2009;Dinarel lo，2010)。IL-6是充当促炎症细胞因子和抗炎细胞因子两者的白细胞介素(卩6七6^611&?6(^^611，2006;(^&1&06?&10，2000)。虽然11^-6可以下调11^-1和了肥-&的合成(0pal&DePalo，2000)，但已经表明IL-6的生成过剩成为许多自身免疫和炎性疾病的基础，且对IL-6信号的阻断在以病理性IL-6生成过剩为特征的疾病中被认为是具有治疗性的(Nishimoto，2010)。可以减少IL-6生成的药剂被认为是抗炎的(Park，Lee，Lee，Kim，&Kim，2007；Tedelind,ffestberg,Kjerrulf,&Vidal,2007)。
[0047]为了检测LPS刺激的NO生成的抑制作用机理，研究iNOS的mRNA和蛋白表达水平。如图3(A)和图3(B)所示，与非处理的细胞相比，LPS处理充分地增加了iNOS mRNA和蛋白表达。用AAIP处理(10、50、100和25(^102411，该刺激的丨^)3 mRNA和蛋白表达水平明显下降。该数据的集体分析表明NO生成的抑制是在LPS刺激的RAW264.7细胞中通过AID处理来下调iNOSmRNA和蛋白表达的结果。获得的NO剂量依赖性抑制使申请人对研究它们的相应基因和蛋白表达产生了兴趣。将RAW264.7细胞用LPS刺激24h以分析AAIP对iNOS转录和翻译的影响，由于先前的研究已经公开了最大的iNOS mRNA表达大约在该时间段发生。正如所预期的，iNOS的翻译和转录水平两者均是受AAIP处理的剂量依赖性抑制。
[0048]为了更深入地研究AAIP的抗炎活性，分析了其对促炎症细胞因子TNF-α、IL-Ιβ和IL-6的生成和转录的影响(图4(A))。我们还进行了RT-PCR以确定AAIP是否抑制这些细胞因子在翻译水平的表达。如图4(A)所示，由于AAIP的处理(10、50、10(^P250yM)，IL-6、IL-l^PT N F - a m R N A翻译水平的L P S诱发的生成显著减少且是浓度依赖性的。这些结果表明在RAW264.7细胞中AAIP处理有效地抑制LPS诱发的促炎症细胞因子在翻译水平的生成。
[0049]由此可知，AAIP显著地减少LPS活化的RAW264.1细胞中促炎症因子的释放，促炎症因子包括TNF-a、IL-1 b、IL-6 和NO (图 4)。
[0050]AAIP 下调MAPK 信号
[0051]对调节抗炎活性的信号通路的研究在药物发现中起到至关重要的作用(Lee等人，
2006)。炎症可以由不同的信号通路诱发。我们确定哪种信号通路涉及AAIP介导的iNOS调节和通过LPS诱发的促炎症细胞因子生成。MAPK途径被确定为调节炎症响应的一种主要的信号通路(Jung，Yoon，Park，Han，&Park，2009;Himaya，Ryu，Qian，&Kim，2010)。为了找到在AAIP对iNOS和促炎症细胞因子的抑制作用中可能涉及的通路，分析了三种不同的MAPK分子p38、Jun氨基末端激酶(JNK)和细胞外信号调节激酶(ERK)的非磷酸化和磷酸化。LPS诱发ERK、JNK和p38的迅速磷酸化，且已公开该磷酸化诱发是在LPS处理的10-30min内进行的。因此，在AAIP处理lh，随后LPS(100ng/mL)刺激30min之后收集用于蛋白印迹的细胞。如图5所示，AAIP(10、50、100和250μΜ)对JNK、ERK和p38磷酸化的抑制作用是剂量依赖性的。因此，这些结果表明，通过LPS刺激的RAW264.7细胞中的MAP激酶介导的途径，经由抑制信号转导来调节iNOS的抑制。
[0052]通过申请人的研究，发现通过AAIP处理对全部形式的MAPK分子的抑制，仅p38和JNK分子被剂量依赖性地抑制，而ERK不被抑制。这些结果表明，p38和JNK途径是在AAIP之后介导iNOS表达的抑制活性的分子机理。此外，先前的研究已经公开了 JNK和p38是iNOS和促炎症细胞因子生成的重要调节剂，且它们的下调可导致那些炎症媒介物的抑制(Jongeneel，1995)。
[0053]由此可以推断AAIP可能经由MAPK、ERK和p38MAPK途径衰减iNOS和促炎症细胞因子的LPS诱发的基因和蛋白表达。因此，AAIP在抗炎疗法中具有潜力，因此可用于治疗炎性疾病的药物或功能性保健食品。
【主权项】
1.从鲍鱼内脏中分离的抗炎肽，其氨基酸序列为Pro-Phe-Asn-Glu-Gly-Thr-Phe-Ala-36『，分子量为1175.20&。2.根据权利要求1的抗炎肽，所述鲍鱼为皱纹盘鲍。3.从鲍鱼内脏中获得权利要求1或2的抗炎肽的方法，所述方法是模拟胃肠道消化方法，先后使用胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶进行水解。4.根据权利要求3的方法，其还包括使用离子交换色谱法和HPLC进行纯化的步骤。5.根据权利要求1或2的抗炎肽在抑制LPS活化的巨噬细胞中促炎症因子的释放中的用途。6.根据权利要求5的用途，其中巨噬细胞为RAW264.7巨噬细胞。7.根据权利要求5或6的用途，其中促炎症因子包括TNF-a、IL-lb、IL-6和NO。8.根据权利要求1或2的抗炎肽在制备用于治疗炎症的药物和保健性食品中的用途。
【专利摘要】本发明用于评估皱纹盘鲍的有益效果，使用多阶段HPLC纯化系统从鲍鱼中纯化抗炎肽(AAIP，鲍鱼抗炎肽)。在串联MS分析中，碎裂结果阐明，具有一氧化氮(NO)抑制活性(IC50＝55.8μM)的AAIP的氨基酸序列为Pro-Phe-Asn-Glu-Gly-Thr-Phe-Ala-Ser(1175.2Da)。同时还研究了AAIP对脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7巨噬细胞的抗炎效果并阐释了分子机理。结果表明AAIP肽经由诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达以剂量依赖性方式抑制LPS诱发的一氧化氮(NO)生成，还显著地降低了促炎症细胞因子的基因转录，促炎症细胞因子例如白细胞介素(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和IL-6。此外，AAIP显著地抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)例如p-p38和p-JNK的磷酸化。这些结果表明，AAIP经由阻断巨噬细胞中的MAPK途径而抑制LPS诱发的炎症响应。因此，AAIP可应用于炎症治疗的药物或保健性食品中。
【IPC分类】C07K7/06, A61P29/00, C07K1/20, A61K38/08, C07K1/18, A23L33/18, C12P21/06
【公开号】CN105440103
【申请号】CN201510594885
【发明人】千忠吉, 苏伟明
【申请人】千忠吉
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年9月17日