产品市场，利 用倍性分析仪鉴别二倍体泥鳅和四倍体泥鳅。挑选成熟的雌性(25.1-48.3g)和雄性(11.3-28.4g)二倍体泥鳅、四倍体泥鳅及大鳞副泥鳅作为亲本，注射催产药物。雌鱼的注射剂量为 LHRH-A2(20yg/kg)和D0M(4mg/kg)，雄鱼剂量减半，注射方法为腹腔一次注射法。约12h后进 行人工授精，获得泥鳅与大鳞副泥鳅纯种(二倍体泥鳅罕X二倍体泥鳅ADD;四倍体泥鳅早 X四倍体泥鳅ΛTT;大鳞副泥鳅罕X大鳞副泥鳅ΛPP))和四种杂种(二倍体泥鳅罕X大鳞 副泥鳅Λ DP;大鳞副泥鳅罕X二倍体泥鳅Λ PD;四倍体泥鳅罕X大鳞副泥鳅Λ TP;大鳞副泥 鳅早X四倍体泥鳅Λ PT)。将泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种分别置于l.OmXO. 5m的长方形 塑料水箱中饲养。随机分别剪取5尾二倍体泥鳅纯种(DD)、5尾四倍体泥鳅纯种(TT)、5尾大 鳞副泥鳅纯种(ΡΡ)和四种杂种(DP、PD、TP和ΡΤ)各5尾的部分尾鳍组织。将每尾鱼的尾鳍组 织分成两份，一份黄豆大小的尾鳍用于倍性检测；另一部分的尾鳍组织存放在装满95%乙 醇的1.5ml的离心管中。参照改进后的醋酸铵/异戊醇法提取基因组DNA，然后用紫外分光光 度计检测DNA浓度，并将各样品的质量浓度稀释至100ngAiL，-20°C保存备用；
[0027]倍性检测方法为:加 200yL细胞核提取液在黄豆大小鳍条样本上，刀片切割数次， 然后加800yL细胞染色液，避光染色lmin，接着用30μπι滤网过滤，然后用roS定容至800yL上 倍性分析仪检测倍性；
[0028]以提取的基因组DNA为模版，设计7个标记的上下游引物(如表1)进行PCR扩增，PCR 反应的总体积为10yL，其中含100ng/yL的模板DNAO. 5yL，1.OyL的lOxBuffer(含Mg2+)，0.2yL 的10mmol/L dNTPs，0.1yL的0.5IU/yL的Taq DNA聚合酶，10nmol/L正向及反向SSR引物各 0.25yL，余量为双蒸水;PCR扩增程序为:PCR循环参数为:94°C5min;然后30个循环，每个循 环包括94°C lmin，退火温度下（各个标记的退火温度见表1) 30s，72°C lmin;最后72°C5min延 伸;然后4°C保存。然后对PCR产物用1-2 %的MetaPhor琼脂糖凝胶进行电泳分析。
[0029] 表1标记名称及其引物序列和PCR退火温度
[0030]
[0031] 通过倍性检测获得的倍性结果（图1)和对PCR产物进行凝胶电泳分析获得的凝胶 电泳结果（图2-4)显示:5个DD纯种样本倍性检测结果均为二倍体，且仅4个泥鳅特有的SSR 标记和线粒体标记有扩增产物;5个TT纯种样本倍性检测结果均为四倍体，且仅4个泥鳅特 有的SSR标记和线粒体标记均有扩增产物;5个PP纯种样本倍性检测结果均为二倍体，且仅2 个大鳞副泥鳅特有的SSR标记和线粒体标记有扩增产物;5个DP样本倍性检测结果均为二倍 体，且泥鳅和大鳞副泥鳅特有的SSR标记均有扩增产物，同时线粒体标记的扩增产物均为大 小285bp的条带;5个样本倍性检测结果均为二倍体，且泥鳅和大鳞副泥鳅特有的SSR标记 均有扩增产物，同时线粒体标记的扩增产物均为大小214bp的条带;5个TP样本倍性检测结 果均为三倍体，且泥鳅和大鳞副泥鳅特有SSR标记均有扩增产物，同时线粒体标记的扩增产 物均为大小285bp的条带，而PT与TP样本唯一不同的是线粒体标记的扩增产物均为大小 214bp的条带。利用本鉴别方法获得的分析结果和已知的泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种的 背景信息完全一致(1 〇〇 %匹配），证明本方法准确可靠。
【主权项】
1. 一种鉴别泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 取待测样本，剪取部分尾鳍组织，将尾鳍组织分成两份，一份黄豆大小的尾鳍组织 用于倍性检测；另一部分的尾鳍组织存放在装满95%乙醇的1.5ml的离心管中，采用醋酸 铵/异戊醇法提取基因组DNA，然后用紫外分光光度计检测DNA浓度，并将样品的质量浓度稀 释至IOOngAiL，-20°C保存备用； (2) 以步骤(1)中的黄豆大小的尾鳍组织为样本，利用倍性分析仪进行倍性检测； (3) 以步骤（1)中的DNA为模版，以7个标记的引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，然后 进行凝胶电泳分析； 所述7个标记的名称及其引物序列为：(4) 对步骤(2)中获得的倍性结果和步骤(3)中获得的凝胶电泳结果进行综合分析，二 倍体的样本中，仅4个泥鳅特有的SSR标记和线粒体标记有扩增产物的样本是二倍体泥鳅早 X二倍体泥鳅Λ仅2个大鳞副泥鳅特有的SSR标记和线粒体标记有扩增产物的样本是大鳞 副泥鳅罕X大鳞副泥鳅Λ在泥鳅和大鳞副泥鳅特有SSR标记都有扩增产物的情况下，线粒 体标记的扩增产物为大小285bp条带的样本是二倍体泥鳅罕X大鳞副泥鳅Λ而线粒体标记 的扩增产物为大小214bp条带的样本是大鳞副泥鳅罕X二倍体泥鳅Λ三倍体的样本中，在 泥鳅和大鳞副泥鳅特有SSR标记都有扩增产物的情况下，线粒体标记的扩增产物为大小 285bp条带的样本是四倍体泥鳅罕X大鳞副泥鳅Λ而线粒体标记的扩增产物为大小214bp 条带的样本是大鳞副泥鳅罕X四倍体泥鳅Λ四倍体的样本是四倍体泥鳅罕X四倍体泥鳅 d，仅4个泥鳅特有的SSR标记和线粒体标记有扩增产物。2. 如权利要求1所述的鉴别泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种的方法，其特征在于，所述步 骤(2)的倍性检测方法为:加200yL细胞核提取液在黄豆大小的尾鳍组织样本上，刀片切割 数次，然后加800yL细胞染色液，避光染色lmin，接着用30μπι滤网过滤，然后用PBS定容至800 yL上倍性分析仪检测倍性。3. 如权利要求1所述的鉴别泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种的方法，其特征在于，步骤 (3)中所述的PCR扩增的总体积为IOyU其中含100ng/yL的模板DNA0.5yL，1.0yI^ IOxBuff er，0 · 2yL的 lOmmol/L dNTPs，0 · IyL的0 · 5IU/yL的Taq DNA聚合酶，lOnmol/L正向及 反向SSR引物各0.25yL，余量为双蒸水。4. 如权利要求1所述的鉴别泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种的方法，其特征在于，步骤 (3)中所述的PCR扩增的程序为:PCR循环参数为:94°C 5min;然后30个循环，每个循环包括 94°C lmin，退火温度下30s，72°C Imin;最后72°C 5min延伸;然后4°C保存。5. 如权利要求1所述的鉴别泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种的方法，其特征在于：步骤 (3)中所述的凝胶电泳分析采用1-2%的MetaPhor琼脂糖凝胶上电泳。
【专利摘要】本发明公开了一种鉴别泥鳅与大鳞副泥鳅纯种和杂种的方法，本发明通过筛选出4个泥鳅特有的微卫星SSR标记(2N18、2N19、4N7和4N17)和2个大鳞副泥鳅特有的微卫星SSR标记(PD30和PD50)，并同时结合1个已知可区分泥鳅和大鳞副泥鳅的线粒体标记(MP)和一种用鳍条进行泥鳅倍性检测的方法，建立了一个可鉴别泥鳅和大鳞副泥鳅纯种和杂种的平台。这对泥鳅和大鳞副泥鳅繁育、选育和杂交育种等工作起着非常重要的作用。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105483243
【申请号】CN201510993152
【发明人】曹小娟, 彭鑫, 徐秀文, 王卫民, 田先畅, 徐佳
【申请人】华中农业大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月23日