CRISPR-Cas9特异性敲除猪PDX1基因的方法及用于特异性靶向PDX1基因的sgRNA的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及基因敲除技术领域，具体涉及 CRISPR-Cas9特异性敲除猪roxi基因的方法及用于特异性靶向roxi基因的SgRNA。
【背景技术】
[0002] 器官移植是治疗器官衰竭疾病最有效的治疗手段。迄今为止，全球已有近百万的 患者通过器官移植而延续生命。随着人口老龄化及医疗技术的进步，需要进行器官移植手 术的病人越来越多，但供体器官的短缺严重制约了器官移植手术的开展。以肾脏移植为例， 我国每年需要进行肾移植的患者多达30万，而可用于移植的捐献肾脏不超过1万例，大部 分患者死于肾衰竭。依靠死后器官捐献已不能满足器官移植的需要。通过基因工程改造其 他物种，以提供合适于人体移植的器官，成为解决人类供体器官短缺问题的主要途径。
[0003] 目前，根据生物安全性、生理功能指标、经济性及稀有物种保护等多方面评价，猪 成为了最为理想的异种器官来源。但猪和人之间存在巨大的差异，直接将猪的器官移植到 人会产生强烈的免疫排斥反应。因此，通过基因工程对猪进行改造，以产生适合于人体移植 的器官，成为异种移植的终极目标。
[0004] 传统的技术路线通过减少猪与人的免疫差异以获得可用于移植的猪的品系。近年 来，利用器官发育缺陷型猪作为培养环境产生由人类细胞构成的器官成为新的思路。通过 基因工程有效干扰控制猪自身器官发育的基因，使猪在发育过程中某个器官缺失，从而为 人源细胞器官的发育提供了关键的培养环境。
[0005] 目前已知Η)Χ1基因是胰腺发育和胰岛beta细胞成熟过程中的必需基因。胰腺在 发育过程中需要前胰腺上皮与间叶组织相互作用。roxi作为Hox类型的转录因子，在此过 程中必不可少。纯合缺失roxi的小鼠会出现胰腺发育缺失并最终死亡。通过人为敲除猪 的roxi基因，我们就可以得到胰腺发育缺失的猪，用于产生人类细胞来源的胰岛。而准确 高效的敲除猪的roxi基因，是人工胰岛生产中的首要步骤。
[0006] 目前，常见的基因敲除技术包括同源重组（Homologus Recombination，HR)技术、 类转录激活效应子核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN) 技术、锌指核酸酶（Zinc-Finger Nuclease，ZFN)技术以及最近发展的规律成簇间隔短回 文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat，CRISPR)技术。 HR技术由于重组效率低下（效率大约只有10 6)，对突变体的筛选工作非常耗时和低效，已 逐渐被取代。TALEN技术和ZFN技术的切割效率一般能达到20%，但都需要构建可以识别 特定序列的蛋白质模块，前期工作繁琐费时。ZFN技术的模块设计较为复杂且有较高的脱靶 率，其应用有限。
[0007] CRISPR是一种源于原核生物的后天免疫系统，该系统执行干扰功能的复合物由蛋 白质Cas和CRISPR-RNA(crRNA)组成。目前该系统已发现有三种类型，其中第二类Cas9 系统组成简单，已被积极应用于基因工程领域。Cas9革El向切割DNA是通过两种小RNA-- crRNA(CRISPR RNA)和 tracrRNA (trans-activating crRNA)与革E序列互补识别的原理实现 的。现在已经将两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA(single guide RNA)，能够识别 特定的基因序列，引导Cas9蛋白进行切割。在真核生物中，DNA被切断后发生非同源重组 末端连接，造成移码突变，最终导致基因功能性敲除。
[0008] 相比于上述3种技术，CRISPR技术操作简单、筛选效率高，能够实现精确的靶向切 害J。因此，通过CRISPR技术敲除roxi基因能够极大地提高roxi缺失细胞及胰腺发育缺失 基因工程猪的筛选效率。但是该路径的关键技术难题是设计并制备精确靶向的sgRNA，因为 基因的靶向精确度高度依赖于sgRNA靶序列，能否成功设计出精确靶向的sgRNA成为敲除 目的基因的关键技术问题，本发明意在解决该技术问题从而为敲除roxi基因提供坚实的 基础。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供CRISPR_Cas9特异性敲除猪Η)Χ1基因的方法及用于特异 性靶向Η)Χ1基因的sgRNA。
[0010] 根据本发明的第一方面，本发明提供在CRISPR_Cas9特异性敲除猪Η)Χ1基因中用 于特异性靶向TOX1基因的SgRNA，该SgRNA具有以下特点：
[0011] ⑴该SgRNA在roxi基因上的靶序列符合5' -N(20)NGG-3'的序列排列规则，其 中N(20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合上述规则的靶序列位 于正义链或反义链；
[0012] (2)该SgRNA在roxi基因上的靶序列位于roxi基因的N端的第1个外显子编码 区，或靶序列的一部分位于roxi基因的n端的第1个外显子，其余部分跨越与相邻内含子 的交界，位于相邻内含子；
[0013] (3)该sgRNA在roxi基因上的靶序列是唯一的。
[0014] 作为本发明的优选方案，上述靶序列为序列表中SEQ ID N0 :1~20中任一条序列 所示的序列。
[0015] 作为本发明的优选方案，上述靶序列为序列表中SEQ ID N0 :3或10所示的序列。
[0016] 根据本发明的第二方面，本发明提供运用CRISPR_Cas9特异性敲除猪Η)Χ1基因的 方法，该方法包括如下步骤：
[0017] (1)在第一方面所述的SgRNA的靶序列的5' -端加上用于形成粘性末端的序列， 合成得到正向寡核苷酸序列；在第一方面所述的sgRNA的靶序列对应的互补序列的两端加 上合适的用于形成粘性末端的序列，合成得到反向寡核苷酸序列；将合成的正向寡核苷酸 序列与反向寡核苷酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链寡聚核苷酸；
[0018] (2)将上述双链寡聚核苷酸连入线性化的携带Cas9基因的表达载体，得到携带含 相应靶序列的sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表达载体，转化感受态细菌，筛选鉴定出正 确的阳性克隆，并对阳性克隆摇菌、提取质粒；
[0019] (3)用上述携带有sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表达载体、包装质粒和包装细 胞系包装出同时携带靶向Η)Χ1基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒；
[0020] (4)使用上述假型慢病毒感染目的细胞，并进一步培养；然后收集被感染的目的 细胞，以其基因组DNA为模板扩增包含上述靶序列的基因片段，经过变性、复性及酶切，确 定roxi基因的敲除情况。
[0021] 作为本发明的优选方案，上述表达载体为序列表中SEQ ID N0 :21所示序列的载 体。
[0022] 作为本发明的优选方案，上述方法包括如下步骤：
[0023] (1)在第一方面所述的sgRNA的靶序列的5' -端加上CACCG序列，合成得到正向 寡核苷酸序列；在第一方面所述的sgRNA的靶序列对应的互补序列的5' -端加上AAAC序 列、3' -端加上C，合成得到反向寡核苷酸序列；将合成的正向寡核苷酸序列与反向寡核苷 酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链寡聚核苷酸；
[0024] (2)将上述双链寡聚核苷酸连入如序列表中SEQ ID N0 :21所示序列的表达载体 lentiCRISPR v2经BsmB I限制性内切酶酶切得到的线性化载体，得到携带sgRNA寡聚核苷 酸的重组表达载体lentiCRISPR V2-PDX1，转化感受态细菌，筛选鉴定出正确的阳性克隆， 并对阳性克隆摇菌、提取质粒；
[0025] (3)用上述表达载体lentiCRISPR V2-PDX1、包装质粒和包装细胞系包装出同时携 带靶向Η)Χ1基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒；
[0026] (4)使用上述CRISPR假型慢病毒感染目的细胞，并进一步培养；然后收集被感染 的目的细胞，以其基因组DNA为模板扩增包含上述靶序列的基因片段，经过变性、复性及酶 切，确定roxi基因的敲除情况。
[0027] 作为本发明的优选方案，上述包装质粒为质粒pLPl、质粒pLP2和质粒pLP/VSVG ; 上述包装细胞系为HEK293T细胞。
[0028] 作为本发明的优选方案，上述目的细胞为猪PIEC细胞。
[0029] 作为本发明的优选方案，上述以其基因组DNA为模板扩增包含上述靶序列的基因 片段，经过变性、复性及酶切，确定roxi基因的敲除情况，具体为：
[0030] (a)以感染病毒的目的细胞的基因组DNA为模板，用Η)Χ1基因的上下游引物扩增 包含上述sgRNA的靶序列的Η)Χ1基因片段，同时用相同引物扩增未感染病毒的野生型细胞 的基因组DNA ;
[0031] (b)纯化上述扩增到的roxi基因片段，然后将来自感染病毒的目的细胞的roxi基 因片段和来自野生型细胞的roxi基因片段分别加热变性、复性，形成杂交DNA分子；
[0032] (c)用Cruiser酶切割复性后的杂交DNA分子；
[0033] ⑷电泳检测酶切产物，检测靶序列介导的roxi基因敲除效果。
[0034] 根据本发明的第三方面，本发明提供在CRISPR_Cas9特异性敲除猪Η)Χ1基因的方 法中用到的重组