表达载体lentiCRISPR V2-PDX1，该重组表达载体的骨架载体的序列如序 列表中SEQ ID N0 :21所示；所携带的靶序列如第一方面的sgRNA的靶序列，优选序列表中 SEQ ID N0 :3或10所示的靶序列。
[0035] 根据本发明的第四方面，本发明提供如第一方面所述的sgRNA或第三方面所述的 重组表达载体lentiCRISPR V2-PDX1在CRISPR-Cas9特异性敲除猪Η)Χ1基因的方法中的 用途。
[0036] 本发明的针对CRISPR_Cas9特异性敲除猪Η)Χ1基因，成功地找到特异性靶向Η)Χ1 基因的sgRNA，将本发明的sgRNA用于CRISPR-Cas9特异性敲除猪Η)Χ1基因的方法中，能够 快速、精确、高效、特异性地敲除猪roxi基因，有效地解决构建roxi基因敲除猪周期长和成 本高的技术问题。
【附图说明】
[0037] 图1为本发明实施例中使用的载体质粒lentiCRISPR v2的质粒图谱；
[0038] 图2为本发明实施例中使用的包装质粒pLPl的质粒图谱；
[0039] 图3为本发明实施例中使用的包装质粒pLP2的质粒图谱；
[0040] 图4为本发明实施例中使用的包装质粒pLP/VSVG的质粒图谱；
[0041] 图5为本发明实施例中酶切验证靶序列的基因敲除效果的电泳检测结果图，其中 Μ表示DNA Marker，WT表示未经过病毒感染和Cas9切割的野生型细胞的PCR产物Cruiser 酶切检测结果，3和10分别表示表1中第3号和第10号靶序列对roxi基因的靶向切割效 果，箭头处表示经Cruiser酶切割得到的小片段。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。这些附图和具体 实施例不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术 人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0043] 以下实施例中涉及的试验材料和试剂：lentiCRISPR v2质粒购自Addgene公司， 包装质粒pLPl、pLP2和pLP/VSVG购自Invitrogen公司，包装细胞系HEK293T细胞购自美 国模式培养物集存库（ATCC)，PIEC细胞购自中国科学院细胞库，DMEM培养基、Opti-MEM培 养基和胎牛血清FBS购自Gibco公司，Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。
[0044] 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》 (第三版）J.萨姆布鲁克一书中描述的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。 [0045] 本发明的概括性的技术方案包括以下五个部分：
[0046] 一、Sus scrofa (猪）PDX1基因 sgRNA革巴序列的选择和设计
[0047] 1. PD)(1基因的sgRNA靶序列选择：
[0048] 在Η)Χ1基因外显子区寻找合适的20bp寡核苷酸序列作为靶序列。
[0049] 2. PD)(1基因的sgRNA靶序列设计：
[0050] 将上述靶序列及互补序列分别添加接头，形成正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸 序列。
[0051] 二、构建PDX1基因的CRISPR载体
[0052] 1.合成上述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，复性形成具有粘性末端的双 链DNA片段（即双链靶序列寡聚核苷酸，也可以称为双链寡聚核苷酸）。
[0053] 2.构建 CRISPR-sgRNA 表达载体：
[0054] 将上述双链DNA片段构建至目标载体（如lentiCRISPR v2,其质粒图谱如图1所 示），形成如lentiCRISPR v2-PD)(l的慢病毒CRISPR载体。
[0055] 三、获得表达H)XlSgRNA的假型慢病毒
[0056] 利用包装质粒、包装细胞系与慢病毒CRISPR载体生产表达H)X1 sgRNA的CRISPR 假型慢病毒。
[0057] 四、感染目的细胞并检测roxi基因敲除效果
[0058] 1.慢病毒感染目的细胞：
[0059] 将如lentiCRISPR V2-PDX1的假型慢病毒加入目的细胞培养基进行感染并进一步 培养。
[0060] 2.检测roxi基因敲除效果：
[0061] 收集目的细胞，以基因组DNA为模板扩增包含靶序列的基因片段，经过变性、复性 及酶切，确定roxi基因的敲除情况。
[0062] 五、roxi基因敲除单克隆的挑选和鉴定
[0063] 1.对于有确定敲除效果的目的细胞群，通过稀释和单克隆培养，分离出若干单细 胞来源的细胞株。
[0064] 2.鉴定单克隆的roxi敲除情况。
[0065] 以下通过实施例详细说明本发明的技术方案及其有益效果。
[0066] 实施例一、Sus scrofa (猪）PDX1基因 sgRNA靶序列的选择和设计
[0067] 靶序列决定了 sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效 特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。
[0068] 1. PD)(1基因的sgRNA靶序列选择
[0069] 针对roxi基因，在靶序列选择上应该遵循下列原则：
[0070] (1)在roxi基因外显子编码区寻找符合5' -N(20)NGG-3'规则的靶序列，其中 N (20)表示20个连续的碱基，其中每个N表示A或T或C或G，符合上述规则的靶序列位于 正义链或反义链；
[0071] (2)选择靠近N端的第1个外显子编码区序列，靶序列可以位于roxi基因的N端 的第1个外显子编码区，或靶序列的一部分位于roxi基因的N端的第1个外显子，其余部 分跨越与相邻内含子的交界，位于相邻内含子；这样的编码区序列的切割会造成roxi基因 的功能敲除，残留截短的序列不会形成有功能的蛋白；
[0072] (3)如果存在多种剪切体，则在共有外显子编码区进行选择，针对roxi基因选择 靠近N端的第1个外显子编码区序列即可满足该条件；
[0073] (4)利用在线序列分析工具（http://crispr. mit. edu/)分析以上革巴序列在猪基 因组中的同源情况，舍弃存在显著同源序列的靶序列，根据评分进一步挑选，所挑选的靶序 列在roxi基因上是唯一的。
[0074] 基于以上原则，选择出表1所示的靶序列集合。
[0075] 表1靶序列集合
[0076]
[0077]
[0078] 2. PDX1基因的sgRNA靶序列设计：
[0079] (1)以lentiCRISPR v2质粒作为表达载体，根据lentiCRISPR v2质粒的特点，在 上述N(20)靶序列的5' -端添加 CACCG序列，形成正向寡核苷酸序列：
[0080] 5' -CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3' ；
[0081] (2)在上述N(20)靶序列的反向互补序列的两端添加序列，形成反向寡核苷酸序 列：
[0082] 5' -AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3' ；
[0083] 正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列可以互补形成具有粘性末端的双链DNA 片段：
[0084] 5' -CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
[0085] 3' -CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5'。
[0086] 实施例二、构建Η)Χ1基因的sgRNA表达载体
[0087] 1.合成DNA插入片段
[0088] (1)合成上述设计的正向和反向寡核苷酸序列
[0089] 寡核苷酸序列可以由商业化的公司（如Invitrogen公司）根据提供的序列具体 合成。本实施例及以下实施例研究了表1中所列的第3号和第10号序列所示的靶序列对 roxi基因的敲除效果。
[0090] 第3号靶序列对应的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列如下：
[0091] CACCGCCCCCTGCGTGCCTGTACAT(SEQ ID NO ：22)；
[0092] AAACATGTACAGGCACGCAGGGGGC(SEQ ID NO :23)。
[0093] 第10号靶序列对应的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列如下：
[0094] CACCGGCCCATGTACAGGCACGCAG(SEQ ID NO ：24)；
[0095] AAACCTGCGTGCCTGTACATGGGCC(SEQ ID NO :25)。
[0096] 将对应的正向和反向寡核苷酸序列退火、复性，形成具有粘性末端的双链DNA片 段。
[0097] 反应体系（20 μ L)如下所示：
[0098] 正向寡核苷酸（10 μΜ) :1 yL
[0099] 反向寡核苷酸（10 μ Μ) :1 μ L
[0100] 10XPCR buffer ：2 yL
[0101] ddH20 ：16 μ L
[0102] 将上述反应体系放入PCR仪，并按以下程序进行反应。
[0103] 反应程序：
[0104] 95 °C , 5min ；
[0105] 80 °C , 5min ；
[0106]