一种甘蔗梢腐病菌的简易分离方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种病菌的分离方法，特别涉及一种甘蔗梢腐病菌的简易分离方法。
【背景技术】
[0002]甘蔗梢腐病是一种叶部病害，其病原镰刀菌是一类主要侵染甘蔗叶片的真菌。由镰刀菌引起的梢腐病是甘蔗生产上的一种重要真菌病害。病原菌主要通过气流传播到甘蔗心叶侵染危害。在气候适宜的地区可常年发病，感病甘蔗品种可造成产量和含糖量的大幅下降。因此，明确不同蔗区的病原种群以及优势种，对选育梢腐病抗病甘蔗品种以及科学防控该病害具有重要的意义。而病原的大量收集是研究该病害最重要的基础之一。
[0003]目前关于甘蔗梢腐病镰刀菌的分离多采用传统组织分离方法。传统组织分离方法:I)消毒酒精、无菌水及相关器具的准备;2)在无菌条件下对发病组织进行消毒、无菌水清洗、将发病组织分割成小块，最后放置于TOA培养基中进行培养。常规分离方法对病害组织表面消毒要求严格，分离过程需全程在无菌条件下进行。常规分离方法的缺陷在于:I)操作过程严格要求无菌条件，需要准备消毒酒精、无菌水、剪刀、镊子等相关器材；2)较为耗时，正常情况下，分离一个样本至少需要10?20分钟，对于田间大量采集样本分离病原十分困难;3)容易受到植物组织中内生细菌的污染而致使病原菌分离失败或降低病原菌分离的效率。《一种小麦纹枯病菌的分离方法》专利申请公开了对小麦纹枯病菌的分离方法，该方法需要用到75%酒精对植物组织进行消毒，然后用无菌水洗涤植物组织表面的酒精。处理3?4个植物组织样本后需更新酒精、无菌水、装酒精和无菌水的器皿、无菌的镊子、解剖刀以及剪刀等。对于大量分离样本的病原真菌，需要消耗大量的酒精，同时还需提前准备无菌水和大量无菌的器皿。无菌水的准备从高温(121°C)灭菌到冷却到可使用的室温至少需要4个小时。耗时较长，且成本相对较高。《一种分离植物病原真菌的方法》专利申请，公开了一种对植物病原真菌的分离方法，但是该方法是直接将植物组织放置在培养基中培养，植物组织中的内生细菌同时也可以在培养基中生长，且细菌的生长速度通常较真菌的生长速度快，可造成目标病原菌的分离失败，或分离出来的目标病原真菌容易与其它真菌和细菌混合生长，增加后面的纯化目标病原真菌的次数，降低分离效率。因此，开发一种分离甘蔗梢腐病菌的简易方法成为提高病原收集效率的迫切需要。
[0004]公开于该【背景技术】部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种甘蔗梢腐病菌的简易分离方法，从而克服现有技术中对操作环境严格、对病菌分尚耗时长、且成本较尚的缺点。
[0006]为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下:
[0007]—种甘蔗梢腐病菌的简易分离方法，包含以下操作步骤:
[0008](I)取有甘蔗梢腐病症状的甘蔗叶片，用自来水将甘蔗叶片表面的尘土清洗干净，晾干；
[0009](2)将步骤(I)中晾干后的甘蔗叶片放入密封容器中再置于温度为25?30°C环境中放置5?7天；
[0010](3)挑取步骤(2)中放置5?7天后甘蔗叶片梢腐病发病部位长出的白色菌丝，接入培养基中25?28°C培养2?3天；
[0011](4)将步骤(3)中培养所得菌落边缘菌丝转入新的培养基中25?28°C培养2?3天，重复操作I?2次，即步骤(4)中挑取菌丝重新培养2?3天后，继续挑取培养所得菌落边缘菌丝转入新的培养基中25?28°C培养2?3天，作如此重复操作I?2次，即得纯化的梢腐病病原囷。
[0012]优选的是，步骤(2)中所述甘蔗叶片经剪切或折叠后放入密封容器中。
[0013]优选的是，所述的密封容器为自封袋或塑料马甲袋。
[0014]优选的是，其中所述的每个自封袋或塑料马甲袋只放置一个甘蔗叶片样本。
[0015]优选的是，步骤(3)、步骤(4)中所述培养基为TOA平板培养基，即马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基。
[0016]本发明方法可以一次性同时处理几十到几百个样品。
[0017]虽然甘蔗梢腐病在田间主要表现为干枯的病斑，但发明人发现，在采集的样本中由于叶片呼吸产生的水分以及温度造成甘蔗叶片在密闭容器中能保持在一个高温高湿的条件下，侵染叶片的梢腐病病原菌通过吸收叶片组织的营养，迅速从发病部位产生大量的白色菌丝体。
[0018]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
[0019]本发明方法降低了梢腐病病原真菌分离过程中的能耗，简易、高效地获得目标病原真菌;尤其对于分离大量样本病原真菌，更有效、及时的实现了分离梢腐病病原真菌，大大缩短了工作时间，提高了工作效率、降低了工作强度，同时降低目标病原菌与其他微生物混合生长的几率，减少了纯化病原菌的次数，也提高了后期纯化目标病原真菌的纯化效率。
【附图说明】
[0020]图1是感染梢腐病的甘蔗叶片。
[0021]图2是从甘蔗叶片发病部位长出的病原菌菌丝。
【具体实施方式】
[0022]下面结合【具体实施方式】进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受【具体实施方式】的限制。甘蔗叶片样品来自广西农业科学院甘蔗研究所繁殖场。
[0023]实施例1
[0024]—种甘蔗梢腐病菌的简易分离方法，操作步骤为:
[0025](I)取明显有甘蔗梢腐病症状的甘蔗叶片，用自来水将甘蔗叶片表面的尘土清洗干净，晾干；
[0026](2)将步骤(I)中晾干后的甘蔗叶片剪切成适当大小片段，放入洁净的自封袋中，密封，每个自封袋放置一个样本甘蔗叶片，避免病原交叉感染，然后将自封袋放在温度为30°C环境中放置5天，放置期间甘蔗叶片由于呼吸产生的水分以及温度造成甘蔗叶片保持在一个高温高湿的条件下，侵染甘蔗叶片的病原菌通过吸收叶片组织的营养，迅速从发病部位产生大量的白色菌丝体；