一株高效阿特拉津降解菌及其应用以及筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及环境微生物技术领域，具体而言，涉及一种用于降解阿特拉津的细菌、筛选方法及其应用。
【背景技术】
[0002]我国作为农业大国，农药的施用量逐年增加。近年来，由于人们不合理的使用农药，加之农药的难生化降解特性，农药常伴随着降水流入河流与土壤中，严重污染地表水与地下水。阿特拉津作为一种北方地区重要的除草剂，因广泛施用已对自然界动植物造成严重危害。如何高效降解污水中的阿特拉津是当前水污染处理领域的热点问题。为了获得稳定高效降解效果，采用微生物修复技术将阿特拉津分解为无毒或低毒物质具有着广泛的发展前景。其中，最为关键之处是筛选具有高效率降解阿特拉津的功能菌株。
【发明内容】
[0003]本发明目的在于提供一种用于降解阿特拉津的细菌及其筛选方法，为受阿特拉津污染地区的快速原位修复奠定理论基础。
[0004]为实现本发明目的，提供了以下技术方案:一株高效阿特拉津降解菌，其特征在于所述菌株为Arthrobacter sp.ZXY-2，于2015年6月I日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC N0.10937。
地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
[0005]一株高效阿特拉津降解菌，其特征在于可应用于阿特拉津农药污染的水体的快速修复。
[0006]为实现本发明目的，提供一种高效阿特拉津降解菌筛选方法，其特征在于包括以下步骤:
(1)取1g农药厂受污染土壤，加入10ml含有100mg/L阿特拉津的无机盐培养基的三角锥形瓶中，在30°C恒温摇床上150r/min驯化培养;每隔7天取驯化培养液接种至新鲜的含有100mg/L的阿特拉津无机盐培养基中，接种量为10%(v/v)；
(2)连续驯化培养30天后，将富集培养物分别稀释10—\10—2、10—3、10—4、10—5、10—6、10 一7、10一8和I O—9倍，各取0.1mL分别涂布于100mg/L阿特拉津固体平板上，置于30 V恒温培养箱中培养2-3天；
(3)挑取单菌落进行细菌纯化培养，重复3次以上直至平板上出现形态大小相同的单菌落；
(4)挑取步骤(3)中的单菌落划线至斜面固体培养基中培养2-3天后，4°C保存。
[0007]作为优选，无机盐培养基组成为:KH2PO4 0.9g/L，Na2HPO4.12H20 6.5g/L,蔗糖3g/L, MgSO4.7H20 0.2g/L, FeSO4.7H20 0.01g/L，以及lml/L微量元素液，其中微量元素液为:CoCl2.6H20 0.lg, MnCl2.4H20 0.425g, ZnCl2 0.05g, NiCl2.6H2O 0.0lg,CuSO4.5H20 0.015g, Na2MoO4.2H20 0.0lg, Na2SeO4^H2O 0.0lg溶于 1000ml蒸馏水中。
[0008]作为优选，斜面培养基为:KH2PO40.9g/L, Na2HPO4.12H20 6.5g/L,蔗糖 3g/L,蛋白胨 lg/L,酵母粉 0.5g/L, NaCl lg/L, MgSO4.7H20 0.2g/L, FeSO4.7H20 0.0lg/L,Iml /L微量元素液以及15-20g/L琼脂。
[0009]作为优选，无机盐固体培养基是在无机盐培养基中另加入琼脂15_20g/L。
[0010]作为优选，无机盐、斜面培养基初始pH为8.0。
[0011]作为优选，无机盐、斜面培养基高压蒸汽灭菌条件为12rc，15min。
[0012]本发明菌株为革兰氏阳性好氧短杆菌，长1.58μηι，宽1.13μηι，无鞭毛，无芽孢，菌株在无机盐固定培养基上生长，形成不透明的淡黄色菌落且边缘光滑。该细菌能够以阿特拉津作为唯一碳氮源生长，可以使初始浓度为100mg/L的阿特拉津在14h内完全降解。该菌株最适生长温度为30-35°C，最适pH为8.0-9.0，最适生长摇床转速为100_200r/min。
[0013]本发明菌株经16SrDNA鉴定，并将其结果通过Blast程序进行同源性比较，该菌株与Arthrobacter TBD185的同源性达99%。其序列如下:
ACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGATCCGGTGCTTGCGCCGGGGATTAGTGGCGAACG
GGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTTGACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACTC
CTCATCGCATGGTGGGGGGTGGAAAGCTTTTTGTGGTTTTGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTA
ATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGAC
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GCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGTAGGGAAGAAGCCCTCTTTGGGGGTGACGGTACTTGCAGAAGAAGCGCCGG
CTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTA
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GCTAATCCCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATC
GCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCACGAAAGTTGGTAACA
CCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCGTGTGGGGGGAGCCGTCGAAGGTGG
本发明有益效果:本发明提供的阿特拉津降解菌株Arthrobacter sp.ZXY-2能够以阿特拉津作为唯一碳氮源，为生物降解阿特拉津点源污染提高经济效益。本发明提供的阿特拉津降解菌株Arthrobacter sp.ZXY-2能够将初始浓度为10mg/!的阿特拉津在14h内完全降解。
【附图说明】
[0014]图1为菌株Arthrobacter sp.ZXY-2原子力显微镜图。
[0015]图2为菌株Arthrobactersp.ZXY-2生长曲线图。
[0016]图3为菌株Arthrobactersp.ZXY-2降解阿特拉津曲线图。
[0017]图4为菌株Arthrobactersp.ZXY-2在有无鹿糖条件下降解图。
[0018]图5为菌株Arthrobactersp.ZXY-2在不同温度下阿特拉津降解图。
[0019]图6为菌株Arthrobactersp.ZXY-2在不同pH值条件下阿特拉津降解图。
[0020]图7为菌株Arthrobactersp.ZXY-2在不同摇床转速条件下阿特拉津降解图。
[0021 ]图8为菌株Arthrobactersp.ZXY-2在不同初始阿特拉津浓度条件下降解图。
【具体实施方式】
[0022]实施例1:本发明菌株从长期施用阿特拉津的吉林化工有限公司农药厂土壤中筛选而来，其筛选方式按以下步骤实现。
[0023](I)取1g吉林化工有限公司农药厂受污染土壤，加入10ml含有10mg/!阿特拉津的无机盐培养基(pH=8)的三角锥形瓶中，在30°C恒温摇床上150r/min驯化培养。每隔7天取驯化培养液接种至新鲜的含有100mg/L的阿特拉津无机盐培养基中，接种量为10%(v/v);
(2)连续驯化培养30天后，将富集培养物分别稀释10—\10—2、10—3、10—4、10—5、10—6、10一7、10一8和10—9倍，各取0.11^分别涂布于1001^/1阿特拉津固体平板上，置于30°(:恒温培养箱中培养2-3天；
(3)挑取单菌落进行细菌纯化培养，重复3次以上直至平板上出现形态大小相同的单菌落；
(4)挑取步骤(3)中的单菌落划线至斜面固体培养基中培养2-3天后，4°C保存。
[0024]其中，无机盐培养基组成为:KH2PO40.9g/L, Na2HPO4-^H2O 6.5g/L,蔗糖 3g/L, MgSO4.7H20 0.2g/L, FeSO4.7H20 0.0lg/L，以及lml/L微量元素液。
[0025]微量元素液为:CoCl2.6H200.lg, MnCl2.4H20 0.425g, ZnCl2 0.05g,NiCl2.6H2O 0.0lg, CuSO4.5H20 0.015g, Na2MoO4^H2O 0.0lg, Na2SeO4^H2O 0.0lg溶于1000ml蒸馏水中。
[0026]斜面培养基为:KH2PO40.9g/L, Na2HPO4-^H2O 6.5g/L,蔗糖 3g/L，蛋白胨lg/L,酵母粉 0.5g/L, NaCl lg/L, MgSO4.7H20 0.2g/L, FeSO4.7H20 0.0lg/L, lml/L微量元素液以及15-20g/L琼脂。
[0027 ]无机盐固体培养基是在无机盐培养基中另加入琼脂15-20g/L 以上培养基均在121°C，高压灭菌15分钟后使用。
[0028]该菌株为革兰氏阳性好氧菌，无鞭毛，无芽孢，菌株在无机盐固定培养基上生长，形成不透明的淡黄色菌落且边缘光滑。
[0029]该菌株透射电镜图如图1所不，为短杆菌，长1.58μηι，宽1.13μηι。
[0030]实施例2:
使用DNA提取试剂盒(Sangon)按照提取步骤提取细菌DNA，而后进行PCR目的片段扩增，PCR反应条件为:94°C预变性5min，再经30个循环的94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸1.5min，再72°C延伸SmiruPCR扩增产物送至大连宝生物公司测序。该菌株经16S rDNA鉴定，并将其结果通过Blast程序进行同源性比较，该菌株与Arthrobacter TBD185的同源性达99%。其序列如下:
ACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGATCCGGTGCTTGCGCCGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCTTGACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACTC
CTCATCGCATGGTGGGGGGTGGAAAGCTTTTTGTGGTTTTGGATGGACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGG