一种甘精胰岛素的制备方法及其制备的甘精胰岛素的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体设及一种人膜岛素类似物一-甘精膜岛素的 制备方法及其制备的甘精膜岛素。
【背景技术】
[0002] 甘精膜岛素是将人膜岛素 A链上天然排列在第21位的天口冬献胺(Asn)置换为甘 氨酸(Gly)，在B链30位的苏氮酸(Thr)上添加2个精氨酸(Arg)而合成的人膜岛索类似物，用 于成人和儿童I型糖尿病W及成人II型糖尿病。其经皮下注射后，分子会立即聚合，并在皮 下形成稳定的六聚体，增加分子间的结合力，延缓溶解和吸收的时间，持续释放少量甘精膜 岛素，从而具有可预见的、有长效作用的、平稳、无峰值的血药浓度/时间特性。甘精膜岛素 因其长效特性，患者仅需要每天一次在固定的时间皮下注射给药，因此用药方便，患者依从 性好。
[0003] 甘精膜岛素都是W固体形式进行商品流通和用于制剂生产。而甘精膜岛素的生产 通常W基因工程大肠杆菌为表达载体，通过大规模发酵及后续一系列纯化处理和超滤浓 缩，获得高纯度甘精膜岛素溶液。由于溶液体积大，直接冷冻干燥耗时长、耗能高。如果用适 当的方法使甘精膜岛素 W固态形式从溶液中沉降出来，分离后的固态甘精膜岛素就可W方 便地进行冷冻干燥，从而解决大体积溶液冷冻干燥带来的耗时长、耗能高、对设备要求高、 操作不便等问题；同时，上述过程还可W进一步提高甘精膜岛素的纯度。因此，现有技术中 出现了如何从甘精膜岛素溶液中获得甘精膜岛素的研究。甘精膜岛素在其B链末端多两个 碱性氨基酸(ArgB31-ArgB32)，导致其等电点较天然人膜岛素及其它的人膜岛素类似物(如 赖脯膜岛素）高。针对甘精膜岛素上述特点，公开号CN102219851A(公开日2011年10月19 日）、名称为"甘精膜岛素结晶的制备方法"的中国发明专利申请，披露了一种制备甘精膜岛 素结晶的方法，包括，从含有重组甘精膜岛素、有机溶剂、锋、酪衍生物、盐W及有机酸的结 晶液中，在pH7.0-9.0的条件下使重组甘精膜岛素结晶，其中所述有机溶剂的浓度为10- 30% (体积/体积），选自乙醇、乙腊、正丙醇或异丙醇。该发明专利申请的实施例1记载的制 备重组甘精膜岛素结晶液中所包含的组分和浓度为:重组甘精膜岛素:3.5g/L，乙腊:20 %， 乙酸:0.7M，苯酪:0.4 %，氯化锋：120mg/L，乙酸钢:0.5M。结晶完成后的上清液中重组甘精 膜岛素的含量为〇.〇5mg/ml。上述现有技术使用了大量乙腊、乙醇等有机溶剂，可能引起残 留溶剂超标，增加后期晶体洗涂时的操作步骤。另外，对于规模达到吨级的工业化生产，进 一步降低结晶上清液中甘精膜岛素的含量，W提高产率和降低成本，具有重要的意义。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的不足，本发明提供一种甘精膜岛素的制备方法。该方法不使用有 机溶剂，析晶后上清液中甘精膜岛素的含量降低至0.01~〇.〇3mg/ml，从而提高了甘精膜岛 素产率，获得的产品中杂质和溶剂残留少。另外，本发明的制备方法得到的甘精膜岛素沉降 体积小易于与上清液分离，洗涂次数少。因此，本发明的制备方法更适合工业化生产。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
[0006] -种甘精膜岛素的制备方法，所述方法W甘精膜岛素溶液为原料，包括如下操作： 先将甘精膜岛素溶液、有机酸、酪衍生物、锋盐和水混合，配制得到结晶液，调pH至3~4,25 ~35°C下保溫1~8小时，然后调抑至7.0~8.0，降低溫度至2~8°C，静置3~5小时，分离固 体和上清液。
[0007] 优选的，所述结晶液在25~35°C下保溫1~6小时，更优选1~3小时，最优选1小时。 [000引优选的，所述结晶液中，甘精膜岛素的浓度为1~4g/L，更优选为1.5~3.5g/L。 [0009]优选的，所述甘精膜岛素为重组甘精膜岛素，所述甘精膜岛素溶液为工程菌发酵 产物经过一系列分离纯化得到的甘精膜岛素浓缩液，甘精膜岛素含量>5g/L，纯度含98%。 [0010]优选的，所述结晶液中，所述有机酸的浓度为0.4~0.8mol/L。
[0011] 优选的，所述有机酸选自乙酸、巧樣酸或甘氨酸，更优选为乙酸。
[0012] 更优选的，所述结晶液中，所述有机酸为乙酸，浓度为0.5~0.7mol/L。
[0013] 优选的，所述结晶液中，所述酪衍生物的浓度为1~5g/L。
[0014] 优选的，所述酪衍生物选自苯酪和间甲酪中的一种或两种;更优选为苯酪。
[0015] 更优选的，所述结晶液中，所述酪衍生物是苯酪，浓度为1.5~3g/L。
[0016] 优选的，所述结晶液中，所述锋盐的浓度为20~200mg/L，更优选为70~lOOmg/L。
[0017] 优选的，所述锋盐选自氯化锋或氧化锋，更优选为氯化锋。
[0018] 更优选的，所述结晶液中，所述锋盐为氯化锋，浓度为70~lOOmg/L。
[0019] 优选的，上述制备方法，还包括用水洗涂得到的固体，冷冻干燥。
[0020] 作为一个优选的实施方式，本发明提供一种重组甘精膜岛素的制备方法，包括如 下步骤：
[0021] 1)在室溫下将计算量的重组甘精膜岛素溶液、乙酸、苯酪和氯化锋加入水中，使重 组甘精膜岛素的浓度为1~4g/L，乙酸的浓度为0.4~0.8mo 1 /L，苯酪的浓度为1~5g/L，氯 化锋的浓度为20~200mg/L，得到结晶液;其中，所述重组甘精膜岛素溶液中重组甘精膜岛 素的含量>5g/L，纯度含98%;
[0022] 2)调节步骤1得到的所述结晶液抑值至3~4,置于25~35°C，保溫揽拌1~3小时；
[0023] 3)调节步骤2得到的结晶液pH值至7.0~8.0,将所述结晶液置于溫度为2~8°C环 境，静置3~5小时；
[0024] 4)离屯、，分离固体和上清液，用水洗涂固体2次，每次洗涂用水为每克固体50ml~ 100ml;将固体冷冻干燥。
[0025] 作为一个更优选的实施方式，本发明提供一种重组甘精膜岛素结晶的方法，包括 如下步骤：
[0026] 1)在室溫下将计算量的重组甘精膜岛素溶液、乙酸、苯酪和氯化锋加入水中，使重 组甘精膜岛素的浓度为1.5~3.5g/L，乙酸的浓度为0.5~0.7mol/L，苯酪的浓度为1.5~ 3g/L，氯化锋的浓度为70~lOOmg/L，得到结晶液;其中，所述重组甘精膜岛素溶液中重组甘 精膜岛素的含量>5g/L，纯度含98% ;
[0027] 2)调节步骤1得到的结晶液抑值至3~4,置于25~35°C，保溫揽拌1小时；
[0028] 3)调节步骤2得到的结晶液pH值至7.0~8.0,将所述结晶液置于2~8°C环境，静置 3~4小时；
[0029] 4)离屯、，分离固体和上清液，用水洗涂固体2次，每次洗涂用水为每克固体50ml~ 100ml;将固体冷冻干燥。
[0030] 本发明还有一个目的在于提供一种甘精膜岛素，所述甘精膜岛素通过上述制备方 法制备得到。
[0031] 本发明中，结晶液抑调节可W采用本领域常规的酸或碱的水溶液，如盐酸、氨氧化 钢、氨氧化钟或氨水。
[0032] 本发明中，如无特殊说明，所述的水为纯化水、注射用水或去离子水等经过纯化处 理的水。
[0033] 本发明所述的甘精膜岛素结晶液中各组分的加入方式不影响发明效果，只要保证 各组分在最终的结晶液中均完全溶解、混合均匀即可。
[0034] 本发明所述制备方法，甘精膜岛素沉析完全后，离屯、、固体洗涂和冷冻干燥采用本 领域常规方法即可。
[0(X3日]公开号CN102219851A(公开日2011年10月19日）、名称为"甘精膜岛素结晶的制备 方法"的中国发明专利申请披露的是如何对已经是固态的甘精膜岛素进行重结晶的方法。 其具体公开了只有在甘精膜岛素结晶液中添加10~30% (体积/体积)的有机溶剂并使结晶 液的pH始终保持在7.0 W上(初始时抑=8.0~9.0，结晶过程中抑=7.0~8.0)，才能获得显 微镜下呈六面体的甘精膜岛素结晶。不可避免的，该方法制备得到的甘精膜岛素结晶会带 有残留的有机溶剂。
[0036] 而本发明则需要解决如何将高纯度的甘精膜岛素溶液中的甘精膜岛素尽可能完 全地沉降出来，得到高纯度、少杂质和残留的甘精膜岛素。显然，上述现有技术并不适于解 决本发明的技术问题。
[0037] 为此，发明人进行了大量试验摸索，发现如果结晶液中不添加有机溶剂，W溫度 (在C