一种赤红球菌xs-2、其生物菌剂及制备方法和应用
【专利摘要】本发明属于农业生物技术领域，具体公开了一株保藏号为CGMCCNo.11562的赤红球菌XS?2，其具有降解化学农药的作用。本发明还提供了含有此赤红球菌的微生物制剂及其制备方法，其是将此赤红球菌与沙雷氏菌、枯草芽孢杆菌及短短芽孢杆菌复配制成，该微生物制剂具有修复农药污染土壤及防病促生的作用，且环境安全性好，具有良好的开发应用前景。CGMCC No. 1156220151030
【专利说明】
一种赤红球菌XS-2、其生物菌剂及制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种赤红球菌XS-2、其生物菌剂及制备 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 目前我国有机农药总施用量达131.2万t(成药），平均施用量为1.40 g/m2,已远 超出发达国家。随着人们生活水平的提高和饮食结构改善，蔬菜和瓜果种植面积大幅度增 加，其农药用量高出粮食作物1-2倍。生产中施用的农药除部分被植物吸收或逸入大气外， 约80%进入土壤中，致使土壤中的农药残留严重。土壤中过量的化学农药污染，不仅破坏了 土壤中生物多样性，造成土壤质量下降，生产能力减弱，而且农作物从土壤中吸收农药，积 累到根、茎、叶、果实及种子中，通过食物链进入人体，引起人体急性或慢性中毒，以及产生 致畸、致突变和致癌等健康损害，已严重威胁到人类健康和农业可持续发展，所以土壤农药 污染的修复问题迫在眉睫。
[0003] 农药污染土壤修复主要有化学修复、物理修复、电化学修复、生物修复技术等。当 前研究应用最为活跃，并取得较好效果的是生物修复技术。生物修复技术中微生物修复技 术是一项环境友好、要求相对较低的修复污染土壤的方法。微生物种类繁多、代谢方式丰富 多样、底物范围广，使其在化学农药污染土壤的生物修复过程中发挥着越来越重要的作用， 并且成本也比传统修复技术要低得多。但是此种修复方式多会由于过快降低农药的含量而 影响农药的最终使用效果。
[0004] 因此，筛选到既能修复农药污染土壤又能对植物防病促生的微生物具有重要意 义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于，针对土壤有机化学农药污染，提供一种能够降解化学农药的 赤红球菌XS-2,及包含该赤红球菌的对植物有防病促生及土壤修复作用的生物菌剂，并提 供该生物菌剂的制备方法和应用。该生物菌剂施用后可有效降低土壤中化学农药的含量， 提高植物的防病促生能力，降低环境污染，提高土壤品质。
[0006] 本发明所采用的技术方案如下： 本发明通过大量筛选工作，得到了一株可有效降解苯并咪唑类化学农药的赤红球菌 XS-2,通过菌体形态、生理生化特征以及16S rDNA分子生物学鉴定，确定该菌株为赤红球菌 XS-2。该菌株已于2015年10月30日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种 保藏中心，保藏号为:CGMCC No. 11562;保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，邮编1 〇〇 1 〇 1。
[0007] 本发明所述的赤红球菌XS-2在ro平板培养基上培养24h后菌落特征为：菌落为圆 形、不透明、干燥、表面凸起、边缘整齐、颜色为橙红色;细胞形态特征为:生长前期细胞为杆 状，菌体长度差异较大，表现为多态性，培养时间增长后变为椭球形。细菌XS-2为好氧菌，革 兰氏染色为阳性，不产生芽孢，生理生化特性具有V.P反应阳性，甲基红反应阴性，接触酶阳 性，氧化酶阳性，不能液化明胶，能利用环糊精、柠檬酸盐、核糖、a-D-葡萄糖、D-果糖、丙酮 酸、甘露糖;不能利用阿拉伯糖和棉子糖。
[0008] 本发明所述的赤红球菌XS-2可降解苯并咪唑类化学农药。
[0009] 本发明还提供了包含所述赤红球菌XS-2的生物菌剂，包括赤红球菌XS-2、保藏编 号为0611〇：如.9621的沙雷氏菌45、保藏编号为0611〇：如.9622的短短芽孢杆菌88(：-3和保 藏编号为CGMCC如.8440的枯草芽胞杆菌850-2，其中所述赤红球菌乂5-2的菌数占所述复合 菌总数的25~40%，沙雷氏菌A5的菌数占所述复合菌总数的10~25%，所述枯草芽胞杆菌 BSD-2的菌数占所述复合菌总数的20~45%，所述短短芽孢杆菌BBC-3的菌数占所述复合菌 总数的15~35%。所述修复菌剂中的细菌总数不低于2X 109 cfu/mL。
[0010] 本发明所述的生物菌剂的制备方法包括以下步骤： 步骤一:将保存的各菌株划线转接到PB培养基平板中，置于30 °C恒温培养2 d。将菌苔 接种于PB种子培养基中，30 °C摇床振荡培养24-36 h，制得种子液。
[0011] 步骤二:将步骤一的种子液按体积比10%的接种量接种到大量发酵培养基中，于30 °C下培养36-48 h，得到发酵液。
[0012] 步骤三:将步骤二的发酵液经镜检计数后，按比例混合，菌液浓度2 2.0 X 109 cfu/ mL，无菌分装，得到液体复合土壤修复菌剂。
[0013] 其中步骤三可用以下步骤替换:将步骤二所得到的各液体发酵液与多种基质按一 定比例混合均匀，进一步通过喷雾干燥制得固体粉剂，然后按比例混合，菌体浓度2 1.0X 101Qcf u/g，得到固体复合土壤修复菌剂。
[0014] 本发明的生物菌剂的制备方法步骤二中所述的大量发酵培养基包含牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，pH 7.0~7.2; 本发明所述的生物菌剂的制备方法中所述的基质为微粉碳酸钙和环糊精;其中质量 比发酵液:微粉碳酸钙环糊精=10: (0.1-1.0): (0.5-1.5)。
[0015] 本发明所述的微生物制剂应用于土壤污染修复，一方面有机化学农药降解率2 90%，另一方面对作物有防病促生作用，可有效抑制灰霉病、白粉病、叶霉病、枯萎病、霜霉病 等病原真菌的生长，其防治效率达70%以上，并对植物生长有一定的促进作用。
[0016] 本发明的有益效果是：1)本发明公布的赤红球菌可有效降解苯并咪唑类农药，尤 其是多菌灵。2)该赤红球菌可与沙雷氏菌、枯草芽孢杆菌和短短芽孢杆菌复合制成土壤修 复菌剂，一方面对土壤化学农药污染有修复作用，另一方面对植物有防病促生作用;3)本发 明制备的微生物菌剂安全、环保，其制备和使用过程无污染、无公害、对环境友好。该菌剂的 应用，可有效减轻土壤化学农药污染状况、改善土壤结构和作物品质，对促进农业健康可持 续发展有重要意义。
[0017] 生物样品保藏信息 赤红球菌乂3_2，分类命名为1?11〇(1〇(3〇(^1181'油61'，该菌株已于2015年10月30日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为:CGMCC No. 11562,保 藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
[0018] 枯草芽孢杆菌BSD-2,分类命名为Busilus subtilis，已于2013年11月6日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCC NO. 8440。
[0019] 短短芽抱杆菌BBC-3，分类命名为Brevibacillus brevis，已于2014年8月28日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCC N0. 9622。 [0020] 沙雷氏菌A5，分类命名为Serratiasp.，已于2014年9月5日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国 科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCC N0. 9621。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明赤红球菌XS-2的系统发育树。
【具体实施方式】
[0022] 以下结合优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅仅用于 说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。
[0023] 实施例1菌株XS-2的筛选、分离及对多菌灵的降解特性 (1)取土样：在经常喷施多菌灵等农药的蔬菜种植区采集土壤样品，铲去表土层2-3 cm，取土壤10 g;装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。 [0024] (2)菌株富集:取土壤放到装有低浓度多菌灵富集培养基的三角瓶中，30 °C摇床 震荡培养5 d。按10%接种量传代至高浓度富集培养基中继续震荡培养，依次传代富集培养 (多菌灵浓度从300-800 mg/L)。
[0025] (3)分离筛选:取0.1-0.2 mL富集液均匀涂布在含多菌灵分离纯化培养基平板上， 30 °C恒温培养5-7 d，筛选出生长快且单菌落相对较大的菌株XS-2,挑取单菌落转接至LB 培养基试管斜面，30 °C培养3 d，4 °C保存备用。
[0026] (4)菌株XS-2对多菌灵的降解特性 将保存于斜面的菌株XS-2接种至LB培养液，30 °C 150 r/min摇床震荡培养24-36 h，然后按培养基体积5-10%的接种量接种到含多菌灵500 mg/L的装有LB培养液的三角瓶 中，在30 °C、150 r/min摇床震荡培养。分别在3、5、7、10(1取培养基液测多菌灵残留，每 个样品做3个重复，以不接菌处理作为对照。多菌灵的测定方法为高效液相色谱法，参见中 华人民共和国农业行业标准NY/T 1680-2009。
[0027] 结果见表1，菌株乂5_1培养3(1时多菌灵的降解率为75.6%，7(1以后多菌灵的降解 率超过90%，对照10 d后降解率仅为3.9%。
[0028]表1菌株XS-2对多菌灵的降解作用
[0029]采用培养基： 富集培养基（g/L):KH2P〇4 2.0，K2HP〇4 3.0，（NH4)2S〇4 1.5，MgS〇4 *71120 0.2，FeS〇4 0.05，MnS〇4 0.05，CaC03 1.0,多菌灵300-800 mg/L去离子水定容，pH值7.0~7.2。
[0030]分离纯化培养基（g/L):KH2P〇4 0.5，K2HP〇4 1.5，NH4C1 1.0，MgS〇4 ? 7H20 0.2， NaCl 1.0,多菌灵500 mg/L，琼脂 15.0 g，pH 7.0~7.2。
[0031 ] LB培养基(g/L):酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，氯化钠10.0，琼脂15.0，去离子水 定容，pH 7.0~7.2。
[0032]无机盐培养基（g/L): KH2PO4 0.5，K2HP〇4 1.5，（NH4)2S〇4 1.5，MgS〇4 ? 7H20 0.2， NaCl 1.0，pH 7.0~7.2〇
[0033] 实施例2菌株XS-2菌种鉴定 根据《常见细菌系统鉴定手册》中记载的实验内容及试验方法，对筛选得到菌株XS-2进 行形态学及生理生化鉴定。该菌株在PB平板培养基上培养24h后菌落特征为：菌落为圆形、 不透明、干燥、表面凸起、边缘整齐、颜色为橙红色;细胞形态特征为:生长前期细胞为杆状， 菌体长度差异较大，表现为多态性，培养时间增长后变为椭球形。细菌XS-2I为好氧菌，革兰 氏染色为阳性，不产生芽孢，生理生化特性具有V.P反应阳性，甲基红反应阴性，接触酶阳 性，氧化酶阳性，不能液化明胶，能利用环糊精、柠檬酸盐、核糖、a-D-葡萄糖、D-果糖、丙酮 酸、甘露糖;不能利用阿拉伯糖和棉子糖(具体见表2)。
[0034] 表2赤红球菌XS-2生理生化鉴定指标
注：十表示阳性反应(存在或有反应）；一表示阴性反应(不存在或无反应）。
[0035] 菌株16S rDNA序列分析:选取处于对数生长期的菌液，用天根公司细菌基因组DNA 提取试剂盒提取菌株基因组DNA，以其为模板，进行PCR扩增。
[0036]扩增引物为细菌通用引物： 正向引物为5Z-AGAGITTGACC TGGCTCAG-3'， 反向引物为Pr: 5' -ACGGCTACCTTGTTACGACT-3'。
[0037] PCR反应程序：在95 °C进行预变性4 min;95 °C 1 min，52 °C 1 min，72 °C 3 min，30个循环延伸;72 °C 10 min。
[0038]由上海生工公司进行PCR产物测序，其16S rDNA序列见序列见附1。测序完成之后 用DNAMAN软件构建系统发育树(具体见图1)。根据菌株形态学、生理生化和16S rDNA序列分 析，该菌株被鉴定为赤红球菌(Rhodococcusruber)。送中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为:CGMCC No. 11562。
[0039] 实施例3~5 土壤修复菌剂液体制剂的制备 将保存的赤红球菌XS-2、沙雷氏菌A5、短短芽孢杆菌BBC-3和枯草芽胞杆菌BSD-2各菌 株划线转接到PB培养基平板中，置于30 °C恒温培养2 d。将菌苔接种于PB种子培养基中，30 °C摇床振荡培养24-36 h，制得种子液。
[0040] 将种子液按体积比10%的接种量接种到大量发酵培养基中，于30 °C下培养36-48 h，得到发酵液。经镜检计数后，按表3所示各菌数比例混合，菌液浓度2 2.0 X 109 cfu/mL，无 菌分装，得到液体复合土壤修复菌剂。
[0041 ] 表3实施例3~5的生物菌剂组成
[0042]实施例6 土壤修复菌剂固体制剂的制备 将保存的赤红球菌XS-2、沙雷氏菌A5、短短芽孢杆菌BBC-3和枯草芽胞杆菌BSD-2各菌 株划线转接到PB培养基平板中，置于30 °C恒温培养2 d。将菌苔接种于PB种子培养基中，30 °C摇床振荡培养24-36 h，制得种子液。
[0043]将种子液按体积比10%的接种量接种到大量发酵培养基中，于30 °C下培养36-48 h，得到发酵液。将各发酵液与基质按表4所示比例混合均匀，进一步通过喷雾干燥制得固体 粉剂，然后按实施例3所示各菌种的比例混合，菌体浓度2 1.0X101() cfu/g，得到固体复合 土壤修复菌剂。
[0044] 表4固体菌剂中各发酵液与基质的质量比
[0045] 实施例3-6中所述的大量发酵培养基包含牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，pH 7.0~7.2。
[0046] 实施例7复合菌剂土壤农药降解实验 选用河北省石家庄周边设施蔬菜大棚内土壤，晒干，研碎，均匀喷洒多菌灵溶液，混匀， 使土壤多菌灵的浓度为100 mg/kg 土，装入直径15 cm、高14 cm的塑料花盆，装量2 000 g/盆，调节土壤水分约为70%田间持水量，放置在25 °C培养箱中，设4个处理，对照组施加清 水，处理组采用实施例3制备的生物菌剂，处理1: 土壤中微生物终浓度为1 X 104 cfu/g;处 理2:土壤中微生物终浓度为1X105 cfu/g;处理3:土壤中微生物终浓度为1X106 cfu/g;每 个处理3次重复。分别在3、5、7、10、15 d后测定土壤中多菌灵含量，计算其降解率。
[0047]表5 土壤修复剂应用实验
[0048] 由表5可知，对照组多菌灵降解很慢，添加复合菌剂后其降解效率显著提高，10 d 后，多菌灵的降解率都大于80%，15天后降解率大于90%。添加菌剂的量越多，相对而言降解 速率越快，如处理3在10 d时，多菌灵的降解率为95.1%，而处理1和处理2的降解率均低于 90% 〇
[0049] 实施例8 土壤修复菌剂田间应用 分别将复合菌剂在石家庄周边经常使用多菌灵的设施番茄和黄瓜上应用，分别设空白 对照组、实验组、处理对照一组和处理对照二组，空白对照组按常规方法管理，实验组在移 栽时土壤穴施实施例6的固体复合菌剂(将固体土壤修复剂与部分草炭混合均匀，平均每亩 地使用1 kg菌剂，菌剂中微生物含量2 1.0X101() cfu/g)，苗期以后叶面喷施实施例5的液 体菌剂3次(液体菌剂微生物含量2 2.0X109 cfu/mL，平均每次每亩地使用500 mL菌剂）， 每隔15 d喷施一次。处理对照一组使用只含赤红球菌XS-2的菌剂，其中微生物含量、使用量 等均与实验组相同，处理对照二组使用只含沙雷氏菌A5、短短芽孢杆菌BBC-3和枯草芽胞杆 菌BSD-2的菌剂，其中微生物总量、各菌种比例以及使用量等均与实验组相同；各组日常管 理按常规操作即可。植物生长期结束后测定土壤中多菌灵和蔬菜产量等。结果见表6。
[0050] 表6 土壤修复剂田间应用
[00511由表6可知，空白对照土壤中检测出多菌灵含量在1-5 mg/kg，只含赤红球菌的菌 剂对土壤中多菌灵有明显的降解作用（降解率为96-98%)，但防病增产效果不明显，而只含 沙雷氏菌、短短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的菌剂对多菌灵的降解相对较低（降解率为30-45%)，但防病增产效果相对较好。而复合了四种菌的实验组土壤中均未检测到多菌灵含量 (检出限0.07 mg/kg)，即对多菌灵的降解几乎达到了 100%，而且黄瓜比对照组增产8.5%，番 茄比对照组增产7.2%。在防病效果上，该菌剂对番茄、黄瓜灰霉病、枯萎病等防效均大于 80%。可见该菌剂中四种微生物之间具有相互促进作用，不仅可以有效降低土壤多菌灵含 量，还有防病促生、降低化学农药施用量等作用。
[0052]以上仅为本发明的较佳实施方式，而不是对其保护范围的限制，本领域技术人员 在本发明的精神和原则指导下所作的任何不具有创造性的改进，均应认为在本发明的保护 范围内。
【主权项】
1. 一种赤红球菌XS-2,该菌于2015年10月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为:CGMCC No. 11562。2. 权利要求1所述的赤红球菌XS-2在土壤修复过程中降解化学农药中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述化学农药为苯并咪唑类农药。4. 包含权利要求1所述的赤红球菌的生物菌剂，其特征在于:该生物菌剂中的总菌数不 低于2X109 cfu/mL液体制剂或1X101Q cfu/g固体制剂。5. 根据权利要求4所述的生物菌剂，其特征在于:还包括保藏编号为CGMCC No.9621的 沙雷氏菌A5、保藏编号为CGMCC ~〇.9622的短短芽孢杆菌88(：-3和保藏编号为061(^ No. 8440的枯草芽胞杆菌BSD-2。6. 根据权利要求5所述的生物菌剂，其特征在于:所述赤红球菌XS-2的菌数占总菌数的 25~40%，沙雷氏菌A5的菌数占总菌数的10~25%，所述枯草芽胞杆菌BSD-2的菌数占总菌数 的20~45%，所述短短芽孢杆菌BBC-3的菌数占总菌数的15~35%。7. 权利要求4-6任一项所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤： 步骤一:将保存的各菌株划线转接到PB培养基平板中，置于30 °C恒温培养2 d; 将菌苔接种于PB种子培养基中，30 °C摇床振荡培养24-36 h，制得种子液； 步骤二:将步骤一的各种子液分别按体积比10%的接种量接种到大量发酵培养基中，于 30 °C下培养36-48 h，得到发酵液； 步骤三:将步骤二的各发酵液经镜检计数后，按比例混合，菌液浓度2 2.0 X 109 cfu/ mL，无菌分装，得到液体复合土壤修复菌剂。8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于用以下步骤替换步骤三:将步骤二所得 到的各液体发酵液分别与基质混合均匀，通过喷雾干燥制得固体粉剂，然后按比例混合，菌 体浓度2 1 .〇X l〇1()cfu/g，得到固体复合土壤修复菌剂。9. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于:所述基质为微粉碳酸钙和β-环糊精， 其与各发酵液的质量比为发酵液:微粉碳酸钙:β-环糊精=10: (0.1-1.〇):(〇.5-1.5)。10. 权利要求4-6任一项所述的生物菌剂的应用，其特征在于：用于修复化学农药污染 的土壤，并对植物产生防病促生作用。
【文档编号】C12R1/125GK105820982SQ201610276747
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】程辉彩, 习彦花, 张丽萍, 崔冠慧, 王宏伟, 邢清朝, 何强, 张根伟, 尹淑丽, 刘洪伟
【申请人】河北省科学院生物研究所