一株羽毛降解菌株及应用
【专利摘要】本发明公开了一种芽孢杆菌<i>Bacillus </i>sp. CJPE209及其应用，该菌株已于2015年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2015734。本发明所选育的菌株可有效解决废弃羽毛的再生利用，得到可利用的氨基酸和多肽，减少环境污染。CCTCC NO：M 201573420151210
【专利说明】
一株羽毛降解菌株及应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体而言涉及一株利用羽毛产角蛋白酶，并降解羽 毛得到氨基酸和多肽的芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 角蛋白是一种不溶于水、盐液、稀酸和稀碱的硬质蛋白。角蛋白来源于外胚层分化 而来的细胞，广泛存在于发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、喙、丝及其他表皮结构中，是羽毛、毛 发、爪、喙、蹄、角以及脑灰质、脊髓和视网膜神经的蛋白质。羽毛作为家禽饲养和屠宰工业 的副产物每年产量巨大、且蛋白质和氨基酸含量丰富，是潜在的优良蛋白质资源。但是角蛋 白结构中的二硫键使其具有抗降解性，不为多数蛋白酶如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白 酶等降解。角蛋白酶为专一性降解角蛋白的一类酶，可由真菌、放线菌和细菌等多种微生物 产生。自然界中羽毛等废弃物得以降解便是由微生物作用所致。羽毛含有超过90%的蛋白 质，因二硫键等存在而不易在自然界降解；另一方面每年世界范围内几百万吨的废弃羽毛 可导致环境污染的危害，蛋白质资源也存在浪费问题，特别是我国蛋白资源不足，对其加工 利用更有实际意义。
[0003] 现今，利用羽毛生产饲料主要利用高温高压处理羽毛，该方式会破坏部分氨基酸、 产品消化率低、耗能高且产品质量不稳定，但使用微生物产角蛋白酶处理羽毛能避免上述 问题的出现。皮革工业中毛皮脱毛也是一项重要的工序，传统方法是利用硫化钠、石灰等化 学物质进行脱毛，该过程对环境的污染较大，会产生大量的固体废物，对水的消耗较大，而 且硫化钠和石灰等化学物质处理毛皮是会对毛皮本身造成一定程度的损坏，使皮革质量下 降，角蛋白酶可以运用于皮革脱毛，特异性强的角蛋白酶可以较好的完成脱毛工序，其对皮 革本身也不会造成损伤。另外，角蛋白酶加入外用药物中可以促进药物吸收，提高疗效。因 此角蛋白酶在食品、医药、饲料、精化和制革等工业中广泛应用。
[0004] 角蛋白酶是一种诱导酶，只有当环境中出现诱导子（角蛋白）时才会合成。目前市 面上没有大量商业角蛋白酶出售，已知的产角蛋白酶的微生物产酶能力大多不高，且大多 无法直接利用未经处理的羽毛。如冀勇良等报道用短小芽孢杆菌液体发酵产酶，酶活最高 为57.14U/mL;Ana Maria Mazotto等用黑曲霉固体发酵产酶降解经氯仿脱脂的鸡毛，发酵 周期7天，酶活最高为172.71]/1^;1\^供〇 6111化等利用链霉菌21121发酵5.5天降解脱脂处理 鸡毛;Ghada E. A. Awad等使用芽孢杆菌利用明胶进行固体发酵产角蛋白酶，周期20天，酶 活仅为730±4.9 U/g。由于这些发酵周期长、降解能力弱、酶活低的菌无法适应工业化生 产，因此筛选一株发酵周期短、降解能力强、酶活力高的菌株十分必要。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明对利用废弃羽毛产角蛋白酶的菌株进行筛选和优 化，得到一株产角蛋白酶较高的菌株。
[0006] 为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验反复进行菌种选育研究，并最终获 得了一株产角蛋白酶酶能力较强的菌株Bacillus Sp.CJPE209,该菌株已于2015年12月10 日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国?武汉?武汉大学），分类命名为Bacillus sp.CJPE209,保藏编号为：CCTCC NO:M 2015734。
[0007] 本发明涉及的高产角蛋白酶的Bacillus sp. CJPE209,具有如下生物学特征： 形态学特征:菌落大，表面粗糙，扁平，不规则，芽孢圆形或柱形，中生或近中生。
[0008] 生理特性:利用蔗糖、葡萄糖、果糖等碳源产角蛋白酶。
[0009] 代谢特性:代谢过程能产角蛋白酶。
[0010] 本发明有如下优势：相对与其他菌株来说，材料处理简单，发酵周期较短（如下 表）。降低工业生产的成本，减少环境污染。并且该菌能以羽毛为唯一碳氮源发酵，在较短时 间内降解羽毛并产酶，且为液体通风发酵，工业化生产对设备要求较低。
【附图说明】
[0011] 图1为Bacillus sp. CJPE209发酵培养48h对羽毛的降解效果图。
[0012] 图2为发酵周期对酶活的影响曲线图。
[0013] 图3为发酵温度对酶活的影响柱形图。
[0014] 图4为摇床转速对酶活的影响柱形图。
[0015] 图5为装液量对酶活的影响柱形图。
[0016] 图6为初始pH对酶活的影响柱形图。
【具体实施方式】
[0017] 以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理 解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。
[0018] 实施例1:菌种的选育 (1)试验中所用的培养基及溶液： 每1000富集培养基含有:葡糖糖10g、NaCl 5g、牛肉膏5g、蛋白胨10g，余量为水、pH自 夕犬. JWS ， 每 1000g筛选培养基含有：羽毛粉 10g、NaCl 58、1(2册0418、1012?040.58、]\%30418、余量 为水、pH自然； 每1000g所述选择性分离培养基含有:干酪素4g、CaC123g、NaCl 5g、牛肉膏5g、琼脂粉 16g、余量为水、pH自然； 每1000g摇瓶上子培养基含有:NaCl 5g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、余量为水、pH自然； 每1000g固体斜面培养基含有:NaCl 5g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、余量为水，pH自然； 每1000g摇瓶复筛发酵培养基含有：羽毛10g、NaCl 5g、K2HP041g、KH2P040.5g、 MgS041g、余量为水、pH自然 无菌生理盐水:取8.5g氯化钠溶于1L的蒸馏水中溶解，0.1 MPa灭菌20min。
[0019] (2)实验步骤 从养鸡场采集土样4份，腐烂鸡毛2份。首先从每份样品中取一定样品，用无菌生理盐水 将样品打散;再用富集培养基37°C培养Id;接着取2mL富集菌液接种到筛选培养基中37°C 培养2d，取筛选培养基中的菌液再次接种到筛选培养基37 °C培养2d，依次重复接种3次;之 后再用生理盐水将第三次筛选培养基上的菌液稀释成不同浓度的菌悬液，取〇.2mL涂布于 选择性分离平板置37°C条件下，培养2-4 d，挑取透明圈大且明显的菌株作为初筛菌株； 挑出平板上的单菌落，接入斜面固体培养基保藏备用。
[0020]最后通过摇瓶发酵试验验证，获得一株可以直接利用未处理羽毛作为碳、氮源的 菌株Bacillus sp. CJPE209。
[0021]实施例2:产酶菌种的培养条件优化 (1) 菌株:实施例1筛选出的菌株Bacillus sp. CJPE209 (2) 方法步骤： 采用单因素试验考察菌株的发酵温度、发酵周期、接种量、摇床转速、初始pH对角蛋白 酶产量的影响。摇瓶初始发酵条件为：菌株Bacillus sp. CJPE209的接种量2%(v/v)，摇瓶 复筛发酵培养基装液量100mL/250mL，37°C，160r/min摇瓶发酵48h。
[0022] a.发酵周期的优选试验 其它发酵条件为初始发酵条件，每隔12h取样测量角蛋白酶酶活，确定菌株产角蛋白酶 的最优发酵周期。由图2可知，当发酵到48h时酶活最高，为297.4U/ml，故选择发酵周期为 48h〇
[0023] b.发酵温度的优选试验 发酵时间取上述试验确定的最优结果，其它发酵条件为初始发酵条件，分别在33°C、35 °C、37 °C、39 °C和41°C摇床中进行发酵培养后测定角蛋白酶酶活，考察温度对菌种产角蛋白 酶的影响。由图3可知，当发酵温度为37°C时，酶活最高为312.8U/ml，故选择发酵温度为37 r。
[0024] c.摇床转速的优选实验 发酵时间和发酵温度取上述试验确定的最优结果，其它发酵条件为初始发酵条件，摇 床转速分别为 120r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min和240 r/min，考察摇床转速对菌种产角蛋白酶的影响，由图4知，当摇床转速为220r/min时，酶活 最高为337.6 U/ml，故选择摇床转速为220r/min。
[0025] d.发酵摇瓶装液量的优选试验 发酵时间、温度、和摇床转速取上述试验确定的最优结果，其它发酵条件为初始发酵条 件，采用250 ml摇瓶装液，摇瓶装液量分别为25 ml、50ml、75 ml、100 ml和125 ml。由图5可 知，当摇瓶装液量为25ml (摇瓶体积250ml)时，酶活最高为332U/ml，故选择装液量为25mL (摇瓶体积250ml)。
[0026] e.初始pH的优选试验 发酵时间、温度、摇床转速和pH试验确定的最优结果，其它发酵条件为初始发酵条件， 调整初始pH分别为5、6、7、8、9和10，，考察pH对菌株产角蛋白酶的影响。
[0027]由图6知，当发酵初始pH为7.0时，酶活最高为312.8U/mL，故选择初始pH为7.0。 [0028]实施例3:羽毛降解实验 将CJPE209以2%(v/v)的接种量接入选择性培养基，使用优化后的最佳培养条件培养， 发酵观察羽毛降解现象，由于培养基无除羽毛外的碳氮源，培养基呈透明澄清状。发酵12h 左右时，羽毛主梗上的细小毛绒脱落，培养基渐渐浑浊;发酵进行到40h时，培养基浑浊，不 透光，羽毛大部分被降解，仅余部分主梗;48h后，培养基中羽毛主梗也被降解，见图1。
[0029]实施例4:与其它降解羽毛微生物的比较 CJPE209与枯草芽孢杆菌、黑曲霉从发酵类型、发酵周期等方面进行比较，具体结果见 下表： 通过对比试验可知，使用CJPE209降解羽
毛时，只需要对需要进行常规的去污处理，不-需要经过高温或脱脂处理，同时发酵的周期也大大缩短，因此CJPE209降解羽毛的效果及使 用方法等方面都优于其它降解羽毛的微生物。
【主权项】
1. 一株羽毛降解菌株Bacillus sp.CJPE209,其特征在于：该菌株Bacillus sp .CJPE209已于2015年12月10日保藏于中国典型培养物包藏中心，分类命名为Bacillus sp.CJPE209,保藏编号为：CCTCC NO:M 2015734。2. -株羽毛降解菌株Bacillus sp.CJPE209的应用，其特征在于:该菌株可直接利用未 经过处理的羽毛。
【文档编号】C12P21/06GK105820979SQ201610259401
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月25日
【发明人】蔡俊, 蒋彪, 王常高, 杜馨, 林建国
【申请人】湖北工业大学