一种脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法
【专利摘要】本发明公开了一种脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法，属于药品技术领域。其制备方法为：中药蟾酥粉碎，乙醇加热提取，提取液减压干燥，得提取物，提取物水中分散，加入乙酸乙酯萃取，收集上部萃取液，减压干燥得萃取物，运用硅胶柱色谱技术，可以获得脂蟾毒配基和华蟾酥毒基高纯度混合物，也可以获得两者单体，单体纯度均大于98％。本发明可以同时分离提取脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体，可以提高治疗的精确性，对不良反应的成分源及时定位，本方法生成的单体纯度高，无有机溶剂残留，操作简便，能耗低，产品质量易于控制，适合工业化生产。
【专利说明】
一种脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种华蟾酥毒基和脂蟾毒配基单体的分离方法，属于药品技术领域。
【背景技术】
[0002]蟾醉(Venenumbufonis)是蟾餘科动物中华大蟾餘(Bufobufo gargarizansCantor)或黑眶蟾蜍(B.melanostictus Schneider)的耳后腺及皮肤腺分泌的白色楽液干燥而成，最早记录于《本草衍义》，“有消积杀虫、温暖通行之功，能发散一切风火抑郁、大热痈肿之候，为拔疔散毒之神药”。现代中医配方中多用此药，具有解毒、消肿、强心和止痛之效，现代药理实验证明，其活性成分具有抗肿瘤、促进癌细胞凋零和防止癌细胞转移等作用，因此被广泛地应用于心脑血管疾病和癌症治疗当中。
[0003]蟾酥中的药用成分主要是华蟾酥毒基和脂蟾毒配基，《中国药典》也将两种化合物的总含量列为蟾酥质量标准之一。两种化合物同属于蟾毒配基类成分，结构相似，无法通过简单的分离手法将两者分开，所以目前蟾酥多采用两种成分混合，以粗提物的形式入药，包含杂质较多，药理作用不稳定，无法广泛应用于注射等西药治疗手段，且一旦发生不良反应，无法及时定位成分源，造成病情延误，阻碍了蟾酥这一传统中药在临床上的进一步应用。本发明运用色谱柱分析法将华蟾酥毒基和脂蟾毒配基分开，分别得到两种单体，流程精简，可重复性和可操作性极高，可广泛应用于工厂化生产。
[0004]现有专利CN103191132A公开了一种从蟾酥中提取脂蟾毒配基的方法，该方法中仅用乙醇对样品进行处理，无法将两种单体华蟾酥毒基和脂蟾毒配基单体同时分离获取。
【发明内容】
[0005]
1、本发明的目的。
[0006]本发明为了提高治疗的精确性，对不良反应的成分源及时定位，而提出了一种华蟾酥毒基和脂蟾毒配基单体的分离方法。
[0007]2、本发明所采用的技术方案。
[0008]本发明是提供一种操作简单，保留原有有效成份，不含有机溶剂的华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的制备方法。其具体步骤如下:
(1)取蟾酥样品粉碎后，乙醇加热回流提取，过滤液减压回收乙醇，得粗提物；
(2)将(I)中粗提物在水中分散，形成悬浊液，加入乙酸乙酯，静置萃取，收集上部萃取液，减压回收溶剂，得萃取物；
(3)连续运用硅胶柱色谱技术对萃取物进行分离，流动相包括石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮和甲醇各比例混合溶剂，通过TLC薄层层析检测，得到华蟾酥毒基和脂蟾毒配基单体。
[0009](4)用冷冻干燥器或者真空干燥器除去有机溶剂残留。
[0010]更进一步的具体实施例中，所述的步骤(3)，连续两次使用硅胶柱色谱技术，在第一次使用，获得脂蟾毒配基和华蟾酥毒基的高纯度混合品，第二次时获得脂蟾毒配基和华蟾酥毒基的单体。
[0011]更进一步的具体实施例中，所述的步骤(I)，乙醇浓度80-95%，体积70-80ml/g。
[0012]更进一步的具体实施例中，所述的步骤(I)，加热温度80°C，提取时间1.5-2小时，提取次数3-4次。
[0013]更进一步的具体实施例中，所述的步骤(2)中，乙酸乙酯与水体积比3:1-1:1。
[0014]更进一步的具体实施例中，所述的步骤(2)中，静置30分钟，萃取次数4-5次。
[0015]更进一步的具体实施例中，所述的步骤(2)可以获得脂蟾毒配基和华蟾酥毒基高纯度的混合物。
[0016]更进一步的具体实施例中，所述的步骤(3)中，色谱柱硅胶为200-300目。
[0017]更进一步的具体实施例中，所述的步骤(3)中，流动相包括:石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和甲醇各比例的混合溶剂。
[0018]更进一步的具体实施例中，所述的步骤(4)中，除去有机溶剂的仪器可以是冷冻干燥器和真空干燥器。
[0019]3、本发明的有益效果。
[0020](I)本发明在乙醇处理除去蟾酥中部分大分子蛋白之后，用乙酸乙酯对样品进行再处理，进一步除去大极性杂质，富集目标化合物，同时用色谱柱进行预分离，除去色素，因此得到的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基的混合品浓度较高，且可以同时得到两种单体成分，减少了样品损耗，精简了分离工艺，提高了单体得率，其纯度均在98%以上。
[0021 ] (2 )脂蟾毒配基和华蟾酥毒基两种化合物同属于蟾毒配基类成分，结构相似，传统两相系统分离度差，得率低，本发明采用三相系统(石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯，石油醚-二氯甲烷-甲醇)，通过TLC检测，分离度高，减少分离过程中样品吸附。
[0022](3)本发明中蟾酥样品，采用《中国药典》2005版蟾酥质量检测目录下所述流程，运用HPLC进行检测，脂蟾毒配基含量为27%，华蟾酥毒基含量37%，符合国家要求。在本发明所述流程结果中，脂蟾毒配基单体获得量22-26mg/g，华蟾酥毒基单体获得量31-35mg/g，得率均在80%以上。
[0023](4)本发明得到脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体，满足载药量小的剂型的制剂要求，防止在临床应用中，多种成分之间相互拮抗，从而降低药效，也为两种化合物进一步生物活性测试，发掘更多更优秀的药理作用奠定基础。进行整个实验流程操作简单，重复性高，质量易于控制，打破了传统意义上的蟾酥混合物入药的局限性，同时也可大规模运用于工厂生产。
[0024](5)传统除去样品溶剂的方法主要是采用旋转蒸发仪，虽会除去大部分溶剂，但仍然会有残留，这会影响后续生物活性测试以及临床应用，所以本发明在利用旋转蒸发仪除去大部分溶剂之后，采用冷冻干燥器和真空干燥器对样品中的有机溶剂进行处理，消除残由ο
【具体实施方式】
[0025]实施例1
取蟾稣样品Ig，加入70倍80%乙醇，800C加热回流提取3次，每次90分钟，过滤液减压浓缩，得乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入I倍乙酸乙酯进行萃取，静置30分钟，萃取3次，取上部萃取液，减压浓缩，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色谱硅胶，流动相二氯甲烷-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(5:1:1)梯度冲洗，得脂蟾毒配基25mg，华蟾酥毒基32mg。
[0026]实施例2
取蟾稣样品Ig，加入70倍90%乙醇，800C加热回流提取4次，每次90分钟，过滤液减压浓缩，得乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入2倍乙酸乙酯进行萃取，静置30分钟，萃取4次，取上部萃取液，减压浓缩，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色谱硅胶，流动相石油醚-丙酮以及石油醚-二氯甲烷-甲醇(5:2:1)冲洗，得脂蟾毒配基24mg，华蟾酥毒基31mg。
[0027]实施例3
取蟾稣样品I g，加入70倍95%乙醇，80 °C加热回流提取3次，每次100分钟，过滤液减压浓缩，得乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入3倍乙酸乙酯进行萃取，静置30分钟，萃取3次，取上部萃取液，减压浓缩，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色谱硅胶，流动相石油醚-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-甲醇(6:3:1)冲洗，得脂蟾毒配基26mg，华蟾酥毒基33mg0
[0028]实施例4
取蟾稣样品I g，加入75倍80%乙醇，80 0C加热回流提取4次，每次120分钟，过滤液减压浓缩，得乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入3倍乙酸乙酯进行萃取，静置30分钟，萃取4次，取上部萃取液，减压浓缩，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色谱硅胶，流动相二氯甲烷-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(3:1:1)冲洗，得脂蟾毒配基23mg，华蟾酥毒基34mg。
[0029]实施例5
取蟾稣样品I g，加入75倍95%乙醇，80 0C加热回流提取4次，每次120分钟，过滤液减压浓缩，得乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入I倍乙酸乙酯进行萃取，静置30分钟，萃取4次，取上部萃取液，减压浓缩，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色谱硅胶，流动相石油醚-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(4:1:1)冲洗，得脂蟾毒配基25mg，华蟾酥毒基35mg0
[0030]实施例6
取蟾稣样品Ig，加入75倍90%乙醇，800C加热回流提取3次，每次90分钟，过滤液减压浓缩，得乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入I倍乙酸乙酯进行萃取，静置30分钟，萃取3次，取上部萃取液，减压浓缩，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色谱硅胶，流动相石油醚-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(5:1:1)冲洗，得脂蟾毒配基23mg，华蟾酥毒基34mg。
[0031 ] 实施例7
取蟾稣样品I g，加入80倍80%乙醇，80 0C加热回流提取3次，每次100分钟，过滤液减压浓缩，得乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入2倍乙酸乙酯进行萃取，静置30分钟，萃取4次，取上部萃取液，减压浓缩，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色谱硅胶，流动相石油醚-丙酮以及石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(6:3:2)梯度冲洗，得脂蟾毒配基25mg，华蟾酥毒基33mg0
[0032]实施例8
取蟾稣样品I g，加入80倍90%乙醇，80 0C加热回流提取4次，每次100分钟，过滤液减压浓缩，得乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入I倍乙酸乙酯进行萃取，静置30分钟，萃取4次，取上部萃取液，减压浓缩，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色谱硅胶，流动相石油醚-乙酸乙酯以及石油醚-二氯甲烷-甲醇(6:1:1)梯度冲洗，得脂蟾毒配基22mg，华蟾酥毒基34mg。
[0033]实施例9
取蟾稣样品I g，加入80倍95%乙醇，80 0C加热回流提取4次，每次120分钟，过滤液减压浓缩，乙醇提取物；乙醇提取物在水中分散，加入I倍乙酸乙酯进行萃取，静置30分钟，萃取4次，取上部萃取液，减压浓缩，得乙酸乙酯萃取物;60倍200-300目柱色谱硅胶，流动相石油醚-乙酸乙酯和石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(4:1:1)梯度冲洗，得脂蟾毒配基23mg，华蟾酥毒基33mg。
[0034]结果与分析
根据多次试验结果分析，本发明涉及的实验流程中，提取过程中乙醇最优浓度为90-95%，乙酸乙酯萃取体积最佳为I倍，此时脂蟾毒配基和华蟾酥毒基均分布在萃取液中，流动相最佳选择为石油醚-乙酸乙酯和石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯，此时两种单体得率最高，分别是均在92%以上。
【主权项】
1.一种脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法，其特征在于按照如下步骤进行: (1)取蟾酥样品粉碎后，用乙醇加热回流提取，过滤液减压回收乙醇，得粗提物； (2)将所述的步骤(I)中粗提物在水中分散，成悬浊液，加入的乙酸乙酯，静置萃取，收集上部萃取液，减压回收溶剂，得萃取物； (3)连续运用硅胶柱色谱技术对萃取物进行分离，流动相包含:石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇和乙酸乙酯比例混合溶剂，分别得到脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体； (4)除去单体中痕量有机溶剂残留。2.根据权利要求1所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法，其特征在于:所述的步骤(3)中，连续两次使用硅胶柱色谱技术，在第一次使用，获得脂蟾毒配基和华蟾酥毒基的高纯度混合品，第二次时获得脂蟾毒配基和华蟾酥毒基的单体。3.根据权利要求1所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法，其特征在于:所述的步骤(I)中，乙醇浓度80-95%，体积70-80ml/g。4.根据权利要求1所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法，其特征在于:所述的步骤(I)中，加热温度80°C，提取时间1.5-2小时，提取次数3-4次。5.根据权利要求1所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法，其特征在于:所述的步骤(2)中，乙酸乙酯与水体积比3:1-1:1。6.根据权利要求1所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法，其特征在于:所述的步骤(2)中，静置30分钟，萃取次数4-5次。7.根据权利要求1所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法，其特征在于:所述的步骤(2)可以获得脂蟾毒配基和华蟾酥毒基高纯度的混合物。8.根据权利要求1或2所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法，其特征在于:所述的步骤(3)中，色谱柱硅胶为200-300目。9.根据权利要求1或2所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法，其特征在于:所述的步骤(3)中，流动相包括:石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和甲醇各比例的混合溶剂。10.根据权利要求1所述的脂蟾毒配基和华蟾酥毒基单体的分离方法，其特征在于:所述的步骤(4)中，除去有机溶剂的仪器可以是冷冻干燥器和真空干燥器。
【文档编号】C07J71/00GK105859824SQ201610209316
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月6日
【发明人】杨智钧, 张友源, 吕爱平, 卞兆祥
【申请人】常熟浸大科技有限公司