专利名称：华蟾素注射乳剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及华蟾素注射乳剂的制备方法，属于医药制剂的生产及加工。
背景技术：
华蟾素为蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bufo bufogargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)皮的乙醇提取物。主要含有蟾素内脂等吲哚类生物碱的有效成分(参见张爱萍，刘明蕊，康建丽等，华蟾素静脉应用的临床护理，医药论坛杂质，2004，25(23)75～76)。以干燥品计，华蟾素中所含的脂蟾酥配基不得少于4％，华蟾酥毒基不得少于5％。
华蟾素注射液是中华大蟾蜍皮的水制剂。基础药理学研究表明华蟾素注射液对肝癌、胃癌和结肠癌细胞有直接杀灭作用；临床研究证明华蟾素注射液主治恶性肿瘤，对消化系统肿瘤、肺癌、宫颈癌及乳癌疗效尤为显著；对慢性乙型肝炎及慢性乙型肝炎病毒携带者亦有明显疗效。水针制剂在临床应用时，用量过大或两次用药间隔时间较短病患出现发冷发热现象，少数病人出现局部刺激，甚至静脉炎。(参见季海宁，李成建。华蟾素的不良反应，医药导报，2002，5(21)157)，该品的不良反应的发生率高达43.28％(参见龚爱平，刘金秀，倪蓓等，华蟾素的不良反应(附201例临床观察)，徐州医学院学报，1998，18(3)418～421)，该不良反应可能为制剂质量欠佳所致的变态反应。
发明内容
本发明拟解决的技术问题针对华蟾素水针制剂所致药物靶向性较弱的不足，研究出一种华蟾素注射乳剂，在发挥其药效同时减少或避免其变态反应。本发明提供了一种制备工艺简单、使用方便、刺激性低、稳定性好的华蟾素注射乳剂，以满足市场上对该药物的需求。
在本发明的华蟾素注射乳剂中用一种或一种以上的注射用油溶解华蟾素，并可选择性地加入一种或一种以上的注射用乳化剂、助溶剂、抗氧剂、等渗调节剂和pH调节剂等药用辅料制备成符合注射要求的乳剂。
本发明华蟾素注射乳剂配方如下
本发明华蟾素注射乳剂是由华蟾素、注射用油、乳化剂、助溶剂、抗氧剂等渗调节剂、pH调节剂和注射用水组成。
本发明所用的华蟾素为蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bufo bufogargarizansCantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)皮的提取物。优选长江以南地处温带至亚热带产中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍。以干燥品计，华蟾素中所含的脂蟾酥配基不得少于4％(优选脂蟾酥配基含量大于7％)，华蟾酥毒基不得少于5％(优选华蟾酥毒基含量大于7.5％)。
本发明乳剂中采用的注射用油选自大豆油，鱼油、亚麻籽油、葵花子油、月见草油、沙棘油、花生油、精炼米糠油、小麦胚芽油、芝麻油、紫苏油、红花油、青刺果油，深海鱼油、油酸、棕榈油、硬脂酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、去氧胆酸、泛酸钠、烟酰胺、油酸、多不饱和脂肪酸、二十五碳五烯酸及其酯、二十六碳五烯酸及其酯、甘油或薏仁油中一种或一种以上的混合物。优选自大豆油，鱼油、亚麻籽油、葵花子油、月见草油、沙棘油、花生油、精炼米糠油、小麦胚芽油、芝麻油一种或一种以上的混合物。
本发明乳剂中采用的乳化剂选自于大豆磷脂、蛋黄磷脂、波洛沙姆、卵磷脂、脑磷脂、黄原胶、蔗糖酯、低酯果胶、阿拉伯胶、人参皂苷、西洋参皂苷、三七皂苷、绞股蓝皂苷、单油酸甘油酯一种或一种以上的混合物。优选自大豆磷脂、蛋黄磷脂、波洛沙姆、卵磷脂、脑磷脂一种或一种以上的混合物。
本发明乳剂中采用的助溶剂选自于尿素、烟酰胺、乙醇胺、丙二醇、PEG4000、甘草酸、水杨酸、琥珀酸钠、磷酸钠、蛋氨酸、醋酸酯、PEG 4000、甘氨酸酯一种或一种以上的混合物。优选于尿素、烟酰胺、乙醇胺、丙二醇、PEG4000一种或一种以上的混合物。
本发明乳剂中采用的抗氧剂选自生育酚、二丁基羟基甲苯、D-木糖、次磷酸、谷胱肝肽、蛋氨酸、栀子黄、L-酒石酸、氢醌、聚丙烯酸、没食子酸、植酸、琥珀酸(钠)、麝香草油一种或一种以上的混合物。优选于生育酚、二丁基羟基甲苯、D-木糖、次磷酸、谷胱肝肽一种或一种以上的混合物。
本发明乳剂中采用的等渗调节剂选自于甘油、山梨醇、氯化钠、氯化钾、蔗糖、甘露醇、葡萄糖一种或一种以上的混合物。
本发明乳剂中采用的pH调节剂优选选自于不同浓度的无机酸包括盐酸、稀硝酸、磷酸、稀硫酸、NH4Cl等，或有机酸包括醋酸、琥珀酸、草酸等，优选盐酸、稀硝酸、稀硫酸；或不同浓度的无机碱包括NaOH、KOH等，或有机碱包括碱性氨基酸、醋酸钠、乳酸钠、乙二胺等；或不同pH的磷酸盐、醋酸盐、氨的缓冲溶液。
本发明所述华蟾素注射乳剂的制备方法包括下列步骤(请分清楚哪些是必须的，哪些是优选的)①油相的制备按处方量取华蟾素、注射用油及可选择的助溶剂，在10～95℃加热搅拌溶解，得油相。
②水相的制备按处方量取注射用水及可选择的等渗调节剂，在10～95℃加热搅拌溶解，得水相。
③选择性地在油相或在水相中加入乳化剂或抗氧剂。
④华蟾素乳剂的制备将油相和水相在10～95℃温度混合(优选混合温度50～70℃)，用剪切乳化或搅拌乳化1～200分钟(优选乳化30～200分钟)，转速为20～8000转/分(优选转速为100～8000转/分)，使油相和水相混合均匀。用pH调节剂调节其pH为3.0～11.0(优选pH为4.0～10.0)，得初乳。将初乳进一步乳化，进一步乳化是选自于高压匀质机均化乳化(压力为500～25000psi，优选1000～25000psi，温度为10～95℃，优选50～95℃)、超声乳化(温度为20～95℃，优选30～95℃，乳化时间1～200分钟，优选20～200分钟)、机械搅拌乳化、或者胶体磨乳化(转速为500～50000转/分，优选1000～50000转/分，乳化时间1～200分钟，优选20～200分钟)，分装，灭菌，乳剂的平均粒径为10nm～5μm(优选10nm～2μm)，得华蟾素乳剂产物。
该乳剂为无色、白色或类白色乳状液体，有时有乳光出现，优选华蟾素在乳剂中的含量为0.03～8％，优选含量为0.03～8％，平均粒径为10nm～5μm(优选10nm～2μm)，pH为3.0～11.0，优选pH为4.0～11.0。
本发明提供的华蟾素注射乳剂载药量大，稳定性好，储藏期可达2年以上。利用本发明的技术方案可制备不同华蟾素含量的乳剂，所述乳剂可直接用于注射，亦可稀释后肌注或滴注，使用方便，既提高了华蟾素的给药靶向性，又保障了输液体运输和使用中的药物稳定性。该制剂毒副作用低，刺激性低，具有良好的生物利用度。本发明的乳剂制备工艺方法简单易行，适用于大量制备和工业化生产华蟾素注射乳剂。
根据本发明的华蟾素注射乳剂的静脉滴注剂量为0.01～1mg/kg体重，优选为0.04～0.5mg/kg体重，1日1～3次；或肌肉注射，1日1～3次。小儿稍减。
具体实施例方式
实施例1制备含有0.03％华蟾素的华蟾素注射乳剂取华蟾素0.5g，大豆油600g，大豆磷脂90g，水浴加热至75℃，搅拌溶解，得油相。量取注射用水1000ml，加入甘油20g，加热至75℃搅拌溶解，得水相。将油相和水相在75℃混合，剪切乳化50分钟(转速8000转/分)，使油相和水相混合。用氢氧化钠溶液(0.1mol/ml)调节其pH为11.0，得初乳。将初乳用高压匀质机匀化乳化(压力1000psi，温度75℃)分装、充氮，高压蒸汽消毒，115℃灭菌30分钟，得产物华蟾素注射乳剂1625ml。该乳剂平均粒径200.6nm，华蟾素含量为0.0028％为标识量的93.3％。按体重0.5mg/kg缓慢滴注，1日3次。小儿稍减。
实施例2制备含有0.1％华蟾素的华蟾素注射乳剂称取华蟾素1.0g，月见草油和芝麻油各200g，氢醌10g，水浴加热至45℃，搅拌溶解得油相。量取注射用水770ml，加入蔗糖和氯化钠各10g，蛋黄磷脂50g和醋酸酯50g加热至45℃溶解搅拌，得水相。将油相和水相在45℃下混合，剪切乳化90分钟(转速20转/分)，使油相和水相混匀。用乙二胺溶液(5％)调节其pH值为7.5，得初乳。将初乳用机械搅拌乳化(转速为2000转/分)100分钟，分装，充氮，高压蒸汽消毒，115℃灭菌30分钟，得产物华蟾素注射乳剂1050ml。该乳剂平均粒径3.0μm，华蟾素含量为0.095％，为标识量的95％。按体重1.0mg/kg缓慢滴注，1日1次。小儿稍减。
实施例3制备含有1.0％华蟾素的华蟾素注射乳剂称取华蟾素10g，红花油400g，大豆磷脂12g和人参皂苷46g以及栀子黄4.5g和D-木糖0.5g，水浴加热至25℃，搅拌溶解得油相。量取注射用水870ml，加入丙二醇0.9g和山梨醇8g，加热至25℃搅拌，得水相。将油相和水相在25℃下混合，搅拌器乳化40分钟(转速2000转/分)，使油相和水相混匀。用乳酸钠溶液(2.0mol/ml)调节其pH值为8.0，得初乳。将初乳用超声乳化50分钟。分装，充氮，高压蒸汽消毒，115℃灭菌30分钟，得产物华蟾素注射乳剂1010ml。该乳剂平均粒径9.5μm，华蟾素含量为0.0099％，为标识量的99.0％。按体重0.6mg/kg缓慢肌肉注射或静脉推注，1日2次。小儿稍减。
实施例4制备含有2％华蟾素的华蟾素注射乳剂称取华蟾素20g，油酸290g、深海鱼油190g和二十五碳烯酸10g，PEG40000 80g和蛋氨酸0.50g，以及二丁基羟基甲苯0.5g，水浴加热至95℃，搅拌溶解得油相。量取注射用水670ml，加入山梨醇和葡萄糖各5g，波洛沙姆5g、绞股蓝皂苷5g和阿拉伯胶6g，加热至95℃溶解搅拌，得水相。将油相和水相在95℃下混合，剪切乳化200分钟(转速6000转/分)，使油相和水相混匀。用磷酸缓冲溶液(pH＝3.0)调节其pH值为3.9，得初乳。将初乳用胶体磨乳化4分钟(转速为50 000转/分)，分装，充氮，高压蒸汽消毒，115℃灭菌30分钟，得产物华蟾素注射乳剂990ml。该乳剂平均粒径10nm，华蟾素含量为2.02％，为标识量的101.0％。按体重0.8mg/kg缓慢滴注或静脉推注，1日3次。小儿稍减。
实施例5制备含有5％华蟾素的华蟾素注射乳剂称取华蟾素5.0g，鱼油5g、葵花子油5g、青刺果油5g，蔗糖酯10g、脑磷脂1.0g和谷胱干肽0.9g一起混合后，水浴加热至65℃，搅拌溶解得油相。量取注射用水75ml，加入甘油2.5g，甘草酸1.5g和水杨酸6.0g，低酯果胶10g加热至65℃溶解搅拌，得水相。将油相和水相在65℃下混合，搅拌器乳化30分钟(转速5000转/分)，使油相和水相混匀。用NH4Cl溶液(1.5mol/ml)调节其pH值为6.5，得初乳。将初乳用高压匀质机匀化乳化(压力50psi，温度65℃)搅拌30分钟，分装，充氮，高压蒸汽消毒，115℃灭菌30分钟，得产物华蟾素注射乳剂101ml。该乳剂平均粒径489.1nm，华蟾素含量为4.95％，为标识量的99.0％。按体重1.0mg/kg缓慢滴注或静脉推注，1日1次。小儿稍减。
实施例6制备含有8.0％华蟾素的华蟾素注射乳剂称取华蟾素70g、沙棘油20g、紫苏油1.6g、大豆磷脂1.5g、卵磷脂9.0g混合物水浴加热至37℃，搅拌溶解得油相。量取注射用水700ml，加入氯化钠18g和氯化钾1.9g，甘氨酸酯6.0g，没食子酸0.5g和麝香草油2.9g加热至37℃溶解搅拌，得水相。将油相和水相在37℃下混合，搅拌乳化30分钟(转速200转/分)，使油相和水相混匀。醋酸钠(3.0mol/ml)调节其pH值为10.0，得初乳。将初乳用超声乳化(温度90℃)30分钟，分装，充氮，高压蒸汽消毒，100℃灭菌100分钟，得产物华蟾素注射乳剂875ml。该乳剂平均粒径147.7nm，华蟾素含量为7.91％，为标识量的98.9％。按体重0.01mg/kg缓慢肌肉或静脉注射，1日3次。小儿稍减。
试验实施例华蟾素注射乳剂质量考察1、华蟾素注射乳剂18个月常温稳定性试验依据中国药典2005版，考察华蟾素注射乳剂在室温25℃±2℃，相对湿度60％±10％条件下放置18个月，分别在放置的1、3、6、9、12、18个月取样一次，考察样品的外观、粒径和含量。外观、粒径和含量三者皆合格者，记录为合格，否则记录为不合格。结果见表1。
表1、华蟾素注射乳剂18个月常温稳定性试验
注实施例1～6的华蟾素注射乳剂的华蟾素浓度分别为0.028％～7.91％。
结果显示依照上述实施例所制备的华蟾素注射乳剂的稳定性较好。产品稳定。
2、华蟾素注射乳剂对H22肝癌肉瘤的抑制作用随机取ICR小鼠84只，单性别，右前腋皮下接种H22小鼠腹水，每鼠0.2ml，细胞浓度为1×107个ml-1。接种24小时后按体重分层随机分为6组，除对照组24只外，其余每组12只①对照组(蒸馏水)，②5-Fu 15mg·kg-1组，③～⑥华蟾素注射乳剂(实施例1、3、4和5)0.028％、0.095％、2.02％和7.91％组。每日1次，连续7天，容积均为10ml·kg-1。结果见表2。
最好有华蟾素注射水针的数据结果显示，华蟾素注射乳剂0.028％～7.91％对H22实体瘤有显著的抑制作用，与对照组比较，华蟾素注射乳剂各组瘤重显著减小(P＜0.05或P＜0.01)，抑瘤率随剂量增加而增大。
表2、华蟾素注射乳剂对小鼠移植H22实体瘤的治疗作用(x±s)
t检验，与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.013、华蟾素注射乳剂的刺激试验取家兔4只，体重2.0～2.5kg，雌雄各半，分为两组，分别在其作左右腿股四头肌注射华蟾素注射乳剂1ml(实施例6，浓度为7.91％)，药后48h，处死剖检股四头肌，纵向切开观察注射局部肌肉刺激反应，按表3换算反应级别。
表3、注射液肌肉刺激反应和反应级别
肉眼观察显示，7.91％的华蟾素注射乳剂刺激反应为0级。即无刺激性。
4、华蟾素注射乳剂的过敏试验取豚鼠12只，按无菌操作，6只为给药组，隔日每只腹腔注射华蟾素注射乳剂(实施例6，浓度为7.91％)0.5ml，共3次，后将其均分两组，一组于首次注射后第14日，静脉注射同样浓度的华蟾素注射乳剂2ml/只进行攻击；另一组于首次注射后的21日同法攻击。蛋清阳性对照组的6只豚鼠隔日每只腹腔注射浓度为(1∶5)的鸡蛋清0.5ml，共3次，后将其随机分两组，于首次(末次)注射后的第14天和第21天，静脉注射浓度为1∶5稀释的鸡蛋清2ml/只进行攻击。于注射后15min内观察是否出现过敏性反应，并按表4确定过敏反应级数。
表4、7.91％华蟾素注射乳剂豚鼠的过敏反应与反应级数
静脉注射结果显示，7.91％的华蟾素注射乳剂过敏性试验合格。
权利要求
1.本发明提供一种华蟾素注射乳剂及其制备方法。即一种用注射用油来溶解华蟾素并用适当乳化剂等药用辅料制备成符合注射要求的乳剂。本发明华蟾素注射乳剂是由下列配方组成组成 含量(重量份数)华蟾素0.5～70注射用油 200～600(优选100～500)乳化剂0～90(优选1～90)助溶剂0～90抗氧剂0～10(优选0.05～10)等渗调节剂适量(优选1～20)pH调节剂 适量(优选0.01～20)注射用水 700～1000
2.如权利要求1所述的华蟾素注射乳剂，其特征在于所述的华蟾素为蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bufo bufogargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictusSchneider)皮的提取物。优选长江以南地处温带至亚热带产中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍。以干燥品计，华蟾素中所含的脂蟾酥配基不得少于4％(优选脂蟾酥配基含量大于7％)，华蟾酥毒基不得少于5％(优选华蟾酥毒基含量大于7.5％)。
3.如权利要求1所述的华蟾素注射乳剂，其特征在于所述注射用油是选自于大豆油、鱼油、亚麻籽油、葵花子油、月见草油、沙棘油、花生油、精炼米糠油、小麦胚芽油、芝麻油、紫苏油、红花油、青刺果油，深海鱼油、油酸、棕榈油、硬脂酸、α-亚麻酸、γ-亚麻酸、去氧胆酸、泛酸钠、烟酰胺、油酸、多不饱和脂肪酸、二十五碳五烯酸及其酯、二十六碳五烯酸及其酯、甘油或薏仁油中中一种或一种以上的混合物。优选自大豆油，鱼油、亚麻籽油、葵花子油、月见草油、沙棘油、花生油、精炼米糠油、小麦胚芽油、芝麻油一种或一种以上的混合物。
4.如权利要求1所述的华蟾素注射乳剂，其特征在于所述乳化剂是选自大豆磷脂、蛋黄磷脂、波洛沙姆、卵磷脂、脑磷脂、黄原胶、蔗糖酯、低酯果胶、阿拉伯胶、人参皂苷、西洋参皂苷、三七皂苷、绞股蓝皂苷或单油酸甘油酯中的一种或一种以上的混合物。优选自大豆磷脂、蛋黄磷脂、波洛沙姆、卵磷脂、脑磷脂一种或一种以上的混合物。
5.如权利要求1所述的华蟾素注射乳剂，其特征在于所述的助溶剂是选自尿素、烟酰胺、乙醇胺、丙二醇、甘草酸、水杨酸、琥珀酸钠、磷酸钠、蛋氨酸、醋酸酯、PEG 4000、甘氨酸酯中的一种或一种以上的混合物。优选自尿素、烟酰胺、乙醇胺、丙二醇、PEG 4000一种或一种以上的混合物。
6.如权利要求1所述的华蟾素注射乳剂，其特征在于所述的抗氧剂是生育酚、二丁基羟基甲苯、D-木糖、次磷酸、谷胱肝肽、蛋氨酸、栀子黄、L-酒石酸、氢醌、聚丙烯酸、没食子酸、植酸、琥珀酸(钠)和麝香草油中的一种或一种以上的混合物。优选自生育酚、二丁基羟基甲苯、D-木糖、次磷酸、谷胱肝肽一种或一种以上的混合物。
7.如权利要求1所述的华蟾素注射乳剂，其特征在于所述的等渗调节剂是选自甘油、山梨醇、氯化钠、氯化钾、蔗糖、甘露醇、葡萄糖中的一种或者一种以上的混合物。
8.如权利要求1所述的华蟾素注射乳剂，其特征在于所述的pH调节剂是选自于不不同浓度的无机酸包括盐酸、稀硝酸、磷酸、稀硫酸、NH4Cl等或有机酸包括醋酸、琥珀酸、草酸等；或为不同浓度的无机碱包括NaOH、KOH等或有机碱包括碱性氨基酸、醋酸钠、乳酸钠、乙二胺等；或为不同pH的磷酸盐、醋酸盐、氨的缓冲溶液。
9.如权利要求1所述的的华蟾素注射乳剂的制备方法，其特征在于包括下列步骤①油相的制备 按处方量取华蟾素、注射用油、助溶剂在10～95℃加热搅拌溶解，得油相。②水相的制备 按处方量取注射用水和等渗调节剂，在10～95℃加热搅拌溶解，得水相。③乳化剂或抗氧剂可同时或分别在油相或水相中加入。④华蟾素注射乳剂的制备 将油相和水相在10～95℃温度混合，用剪切乳化或搅拌乳化1～200分钟，转速为20～8000转/分，使油相和水相混合均匀。用pH调节剂调节其pH为3.0～11.0，得初乳。将初乳进一步乳化，进一步乳化是选自于高压均化乳化(压力为500～25000psi，温度为10～95℃)、超声乳化(温度为20～95℃，乳化时间1～200分钟)、机械搅拌乳化、或者胶体磨乳化(转速为500～50000转/分，乳化时间1～200分钟)，分装，灭菌，乳剂的平均粒径为10nm～10μm，得华蟾素乳剂产物。
全文摘要
本发明提供一种华蟾素注射乳剂及其制备方法，即用一种或一种以上的注射用油来溶解华蟾素并用适当乳化剂、助溶剂、抗氧剂、等渗调节剂、pH调节剂等药用辅料制备成乳剂。将华蟾素、注射用油和助溶剂在水浴中搅拌得油相，将注射用水、等渗调节剂加热搅拌得水相，乳化剂和抗氧剂可同时或分别在油相或水相中加入，将油相和水相混合进行乳化得初乳，再进一步乳化，通过搅拌，高压均化等工艺制备出符合注射要求的华蟾素乳剂。该乳剂稳定，可抑制肿瘤的生长，无明显的刺激作用，可以直接用于注射或稀释后注射。华蟾素注射乳剂既可作为抗癌药华蟾素的载体，又能作为一种能量补充剂。产品载药量大、性质稳定、储存期长、使用方便、制备工艺快速简便，可适用于大量制备和工艺化生产。
文档编号A61P35/00GK1846712SQ20061003287
公开日2006年10月18日 申请日期2006年1月16日 优先权日2006年1月16日
发明者傅卫国, 王伟, 王佩贤 申请人:广州安健实业发展有限公司