专利名称：蟾皮提取物、其药物制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种蟾皮提取物，该提取物的制备方法及所述蟾皮提取物加入药用辅料后制成的各种中药制剂。
背景技术：
蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufomelanostictus Schneider的干燥全皮。蟾皮的化学成分主要有华蟾酥毒基，脂蟾毒配基，蟾毒灵等，以及由它们与琥珀酸，丁二酸，精氨酸等形成的酯类，如蟾毒灵-3-丁二酰精氨酸酯，蟾毒它灵-3-丁二酰精氨酸酯，华蟾毒精-3-丁二酰精氨酸酯，脂蟾毒配基-3-丁二酰精氨酸酯等。还含有吲哚类生物碱，如5-羟色胺，蟾蜍色胺，蟾蜍季胺，蟾蜍噻宁和脱氢蟾蜍色胺等，另外尚含氨基酸、多肽及甾醇类化合物。蟾皮具有清热解毒，利水清胀功效，用于治疗痈疽、肿毒、瘰疬、肿瘤，疳积腹胀，慢性气管炎等。目前，蟾皮提取物制剂主要有华蟾素注射液、华蟾素片剂、华蟾素口服液等，其中华蟾素注射液更是一种传统的生物药制剂、广泛用于临床，具有解毒、消肿、止痛的功效，临床上主要用于治疗中晚期肿瘤、慢性乙型肝炎，还用于治疗顽固性呃逆、扁平疣及银屑病等症。
目前相关的报导有“一种华蟾素胶囊及其制备方法”(专利申请号98103562)其蟾皮提取工艺为水提醇沉法，虽然工艺简单，但杂质较多。“一种纳米华蟾素制剂药物及其制备方法”(专利申请号00136668)该法虽用微波萃取，但未经分离，仍然杂质较多。同时该方法对于工艺设备要求严格，目前难以实施。还有一种“华蟾素冻干粉针剂及其制备方法”(专利申请号200410083994.4)，工艺中蟾皮虽经乙醇提取，大孔吸附树脂纯化，但该工艺中使用80％的乙醇提取，且使用的大孔吸附为非极性或弱极性的树脂大孔吸附树脂洗脱的乙醇浓度为35％～45％，所以其出膏率仍比较高，1.20％～1.38％(w/w)，所含杂质量仍比较多。“一种新的华蟾素冻干粉针及其制备方法和质量控制方法”(专利申请号200510061288.4)，其中蟾皮提取物为水提醇沉法，存在的问题仍然是出膏率大，杂质含量多。“一种华蟾素冻干粉针的制备方法”(专利申请号200510115451.0)，其中蟾皮提取物仍为水提醇沉法，有效成分提取不完全，出膏率大，杂质含量多。
作为目前市场上蟾皮的主要产品，华蟾素注射液，其蟾皮提取物的制备工艺为水提醇沉，出膏率大，杂质含量高，其中吲哚类总生物碱含量仅为7.0％～10.0％，华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量仅为0.001％～0.005％。
发明内容
本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种蟾皮提取物、其药物制剂及其制备方法，在保证药效的前提下，尽可能提高蟾皮提取物中吲哚总生物碱及华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。通过有效控制中药制剂的原料质量，达到制剂体积小、用量少，提高临床疗效、降低副作用的效果。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的本发明蟾皮提取物，其特征是所述提取物中吲哚类生物碱的含量为25％～40％，华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量为0.01％～0.05％。
本发明蟾皮提取物的中药制剂，其特征是所述中药制剂是以所述蟾皮提取物为药物有效成份，加入药用辅料后制成的注射剂、输液剂、注射用粉针剂。
本发明蟾皮提取物的制备方法，其特征是按如下步骤操作a、取干蟾皮，洗净，加6～7倍量85％甲醇或乙醇或丙酮浸泡2小时，回流提取60分钟，放冷，过滤，残渣加5～6倍量85％甲醇或乙醇或丙酮，回流提取50分钟，放冷，过滤，合并滤液；b、步骤a所得滤液经减压浓缩至无溶剂味，加入相当于药材量1～2倍量的水进行溶解，静置24小时后过滤；c、步骤b所得滤液上大孔吸附树脂柱，采用中极性或极性大孔吸附树脂，先用2～3倍柱体积水洗脱，再用3～4倍柱体积50％～65％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，60℃真空干燥，得蟾皮提取物。
本发明蟾皮提取物的制备方法的特征也在于所述中极性或极性大孔吸附树脂为聚苯乙烯型或交联丙烯树脂类，包括HPD-400、DM301或HPD-600，粒度为0.3mm～1.25mm。
本发明有益效果体现在1、本发明蟾皮提取物是以有效成分吲哚类总生物碱，华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量进行表征，以这一表征方式的华蟾素注射剂、华蟾素输液剂和注射用华蟾素冻干粉针剂有显著的抗肿瘤和治疗慢性乙型肝炎等作用。
2、本发明蟾皮提取物采用85％的甲醇或乙醇或丙酮进行提取，使有效成分吲哚总生物碱和蟾毒酯类成分充分提取出来，而分子量大的肽类、蛋白质等成分难以提取出来。粗提物经大孔吸附树脂分离后，去除了水溶性杂质，富集了有效成分。
3、本发明由于在提取时使用浓度为85％的溶剂，并采用中极性或极性树脂，因而使所得的蟾皮提取物出膏率降低为0.2％～1.0％，用这种蟾皮提取物制成的中药制剂体积小、服用量小，临床使用方便。
4、本发明可以满足肿瘤和乙肝患者对不同剂型的需求。
吲哚类总生物碱含量测定参照华蟾酥注射液部版标准(WS3-B-3045)进行，以5-羟色胺为对照品，以15％对-二甲氨基苯甲醛为显色剂，用紫外分光光度法测得本品含吲哚类总生物碱含量为25％～40％。
华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量测定是参照中国药典2005年版一部蟾酥项下HPLC法测定，结果本品中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的总量为0.01％～0.05％。
以下药理实验结果阐明其药效作用1、抗乙型肝炎病毒实验研究1目龄雄性麻鸭，体重45g±5g；鸭乙型肝炎病毒DHBV-DNA强阳性血清，采自上海麻鸭，-70℃保存。
取1日龄麻鸭，经腿胫静脉注射上海麻鸭DHBV-DNA阳性血清，每只0.2ml。DHBV感染第13天，将雏鸭随机分成3组对照组、安徽金蟾药业总公司出品的华蟾素注射液组、本发明华蟾素输液组，每组10只。每日自麻鸭腿胫按2ml/kg体重静脉注射给药，每日1次，连续10天，阳性对照组给与等量生理盐水。以上各组分别在给药前(即感染第13天)、给药后第5天、给药后第10天、停药后第2天自鸭腿静脉采血，分离血清，-70℃保存备用。
取上述血清点于NC膜，按缺口翻译试剂盒说明书操作，用32P标记DHBV-DNA探针，作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，在酶标仪上测定D值(滤光片波长为490nm)，计算血清DHBV-DNA光密度。结果如下表1华蟾素在鸭体内对DHBV-DNA的抑制作用(x±s)
与自身给药前比较*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组相比ΔP＜0.05。
2、对小鼠移植性肿瘤S180的生长抑制作用选取接种S180瘤细胞后7天的小鼠，脱颈处死，无菌抽取腹水，用生理盐水调细胞浓度至1×107个/mL。以每只小鼠0.2mL接种于小鼠有腋下皮下，制备荷瘤小鼠模型。将荷瘤小鼠随机分成3组对照组、安徽金蟾药业总公司出品的华蟾素注射液组、本发明华蟾素输液组，每组8只。每日小鼠尾静脉注射给药一次，按0.2ml/只给药，每日1次，连续10天，阳性对照组给与等量生理盐水。于第11日处死小鼠，小心剥离瘤块，称瘤重，计算抑瘤率。结果见表2。
表2华蟾酥输液对S180荷瘤小鼠瘤重的影响(x±s)
与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
以下通过具体实施方式
对本发明作进一步描述
具体实施例方式本实施例蟾皮提取物中吲哚类生物碱的含量为25％～40％，华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量为0.01％～0.05％。
本实施例蟾皮提取物中药制剂是以蟾皮提取物为药物有效成份，加入药用辅料后制成的注射剂、输液剂、注射用粉针剂。
本实施例蟾皮提取物的制备方法是按如下步骤操作1、取干蟾皮，洗净，加6～7倍量85％甲醇或乙醇或丙酮浸泡2小时，回流提取60分钟，放冷，过滤，残渣加5～6倍量85％甲醇或乙醇或丙酮，回流提取50分钟，放冷，过滤，合并滤液；2、步骤1所得滤液经减压浓缩至无溶剂味，加入相当于药材量1～2倍量的水进行溶解，静置24小时后过滤；3、步骤2所得滤液上大孔吸附树脂柱，采用中极性或极性大孔吸附树脂，具体可以是聚苯乙烯型或交联丙烯树脂类，包括HPD-400、DM301或HPD-600，粒度为0.3mm～1.25mm。先用2～3倍柱体积水洗脱，再用3～4倍柱体积50％～65％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，60℃真空干燥，得蟾皮提取物。
实施例1
取干蟾皮500g，洗净，加6倍量85％甲醇浸泡2小时，回流提取60分钟，放冷，过滤，残渣加5倍量85％甲醇回流50分钟，放冷过滤，合并滤液。
滤液减压浓缩至无醇味，加入相当于药材1.5倍量水溶解，放置24小时，过滤。
滤液上HPD-400型大孔吸附树脂柱，先用3倍柱体积水洗脱，再用4倍柱体积50％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，于60℃真空干燥，得蟾皮提取物4.0g。
实施例2取干蟾皮500g，洗净，加6倍量85％乙醇浸泡2小时，回流提取60分钟，放冷，过滤，残渣加5倍量85％乙醇回流提取50分钟，放冷，过滤，合并滤液。
滤液减压浓缩至无醇味，加入相当于药材2倍量水，溶解，放置24小时，过滤。
滤液上HPD-600型大孔吸附树脂柱，先用3倍柱体积水洗脱，再用3倍柱体积50％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，于60℃真空干燥，得蟾皮提取物3.5g。
实施例3取干蟾皮500g，洗净，加6倍量85％丙酮浸泡2小时，回流提取60分钟，放冷过滤，残渣加6倍量85％丙酮回流提取50分钟，放冷过滤，合并滤液。
滤液减压浓缩至无丙酮味，加入相当于药材2倍量水溶解，放置24小时，过滤。
滤液上DM301大孔吸附树脂柱，先用2倍柱体积水洗脱，再用3倍柱体积60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，于60℃真空干燥，得蟾皮提取物2.7g。
实施例4取干蟾皮500g，洗净，加6倍量85％乙醇浸泡2小时，回流提取60分钟。放冷过滤，残渣加5倍量85％乙醇回流提取50分钟，放冷，过滤，合并滤液。
滤液减压浓缩至无醇味，加入相当于药材1.5倍量水溶解，放置24小时，过滤。
滤液上HPD-400大孔吸附树脂柱，先用3倍柱体积水洗脱，再用3.5倍柱体积50％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，于60℃真空干燥，得蟾皮提取物3.1g。
实施例5取干蟾皮500g，洗净，加6倍量85％甲醇浸泡2小时，回流提取60分钟。放冷过滤，残渣加5倍量85％甲醇回流提取50分钟，放冷，过滤，合并滤液。
滤液减压浓缩至无醇味，加入相当于药材2倍量水溶解，放置24小时，过滤。
滤液上DM301大孔吸附树脂柱，先用2倍柱体积水洗脱，再用3倍柱体积50％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，于60℃真空干燥，得蟾皮提取物3.3g。
实施例6
取干蟾皮500g，洗净，加6倍85％丙酮浸泡2小时，回流提取60分钟，放冷，过滤，残渣加5倍量85％丙酮回流提取50分钟，放冷过滤，合并滤液。
滤液减压浓缩至无丙酮味，加入相当于药材2倍量水溶解，放置24小时，过滤。
滤液上HPD-600大孔吸附树脂柱，先用3倍柱体积水洗脱，再用4倍柱体60％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，于60℃真空干燥，得蟾皮提取物2.8g。
实施例7华蟾素注射液组成蟾皮提取物1.0～5.0g氯化钠9g注射用水 1000ml制备过程取上述蟾皮提取物及药用辅料，加新煮沸过的注射用水溶解，并稀释至规定体积，调节pH5.0～8.0，用3号垂熔玻璃漏斗过滤，灌封，每安瓿装2ml，灭菌，即得。
实施例8华蟾素输液组成蟾皮提取物1.0～5.0g氯化钠45g注射用水 5000ml制备过程取上述蟾皮提取物及药用辅料，加新煮沸过的注射用水溶解，并稀释至规定体积，调节pH5.0～8.0，用0.20～0.80μm微孔滤膜过滤，灌装，每瓶装250ml，灭菌，即得。
实施例9注射用华蟾素冻干粉针组成蟾皮提取物1.0～5.0g甘露醇100～200g泊络沙姆 2～8g制备过程取上述蟾皮提取物及药用辅料，加新煮沸过的注射用水溶解，并稀释至2000ml，调节pH5.0～8.0，用0.20～0.80μm微孔滤膜过滤，灌装500个西林瓶中，冷冻干燥，即得。
权利要求
1.一种蟾皮提取物，其特征是所述提取物中吲哚类生物碱的含量为25％～40％，华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量为0.01％～0.05％。
2.一种权利要求1所述蟾皮提取物的中药制剂，其特征是所述中药制剂是以所述蟾皮提取物为药物有效成份，加入药用辅料后制成的注射剂、输液剂、注射用粉针剂。
3.根据权利要求1所述的蟾皮提取物的制备方法，其特征是按如下步骤操作a、取干蟾皮，洗净，加6～7倍量85％甲醇或乙醇或丙酮浸泡2小时，回流提取60分钟，放冷，过滤，残渣加5～6倍量85％甲醇或乙醇或丙酮，回流提取50分钟，放冷，过滤，合并滤液；b、步骤a所得滤液经减压浓缩至无溶剂味，加入相当于药材量1～2倍量的水进行溶解，静置24小时后过滤；c、步骤b所得滤液上大孔吸附树脂柱，采用中极性或极性大孔吸附树脂，先用2～3倍柱体积水洗脱，再用3～4倍柱体积50％～65％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，60℃真空干燥，得蟾皮提取物。
4.根据权利要求书3所述的制备方法，其特征是所述中极性或极性大孔吸附树脂为聚苯乙烯型或交联丙烯树脂类，包括HPD-400、DM301或HPD-600，粒度为0.3mm～1.25mm。
全文摘要
蟾皮提取物、其药物制剂及其制备方法，其特征是所述提取物中吲哚类生物碱的含量为25％～40％，华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量为0.01％～0.05％。本发明在保证药效的前提下，尽可能提高蟾皮提取物中吲哚总生物碱及华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。通过有效控制中药制剂的原料质量，达到制剂体积小、用量少，提高临床疗效、降低副作用的效果。
文档编号A61P31/20GK1931190SQ20061009607
公开日2007年3月21日 申请日期2006年9月13日 优先权日2006年9月13日
发明者周亚球, 刘金旗, 吴涛 申请人:周亚球