奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌及其分离方法
【专利摘要】一种奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌及其分离方法，属于生物技术领域。本发明的目的是在奶牛粪便中分离出甲烷氧化菌的奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌及其分离方法。本发明的菌株，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC No.11836。本发明的有益效果是：甲烷氧化菌能够以温室气体甲烷作为碳源进行生长，对于减少甲烷产生即减少温室效应具有一定作用。甲烷氧化菌能降解卤化碳氢化合物，在自然界碳循环和工业生物技术以及环境治理中具有重要的应用价值。以甲烷氧化菌为主要成分制备益生菌制剂应用于临床，对于由反刍动物瘤胃发酵引起的甲烷废气排放及动物摄入能量的浪费起到至关重要的作用。CGMCC No. 1183620151207
【专利说明】
奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌及其分离方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着温室效应的日益加剧，温室气体研究已引起各国学者的广泛关注。甲烷是一 种仅此于二氧化碳的温室气体。研究表明，甲烷(CH 4)的温室效应是二氧化碳(CO2)的20~ 30倍，对全球气候变暖的影响作用占15%~20%。在全球家畜的甲烷排放量中，反刍动物占 97%，而牛类(除水牛外）约占75%。在我国，动物胃肠道发酵排放甲烷量占甲烷总排放量的 29.7%。研究认为，通常奶牛生产中有6%~10%的摄入总能被转化为甲烷，以嗳气的形式排 放到大气中。反刍动物甲烷的排放不仅造成了摄入量的巨大损失，同时也造成了对环境得 污染。因此，如何减少反刍动物甲烷排放，对减缓气候变暖和高效利用饲料具有重要现实意 义。
[0003] 反刍动物排放甲烷与其特有的消化生理特点有关。反刍动物可通过瘤胃和后肠发 酵产生甲烷。据估测，约94%的甲烷是由瘤胃产生的。反刍动物瘤胃中有大量纤维分解菌、 产甲烷菌和其他厌氧微生物，饲料进入瘤胃后首先进行厌氧发酵，微生物将碳水化合物和 其他植物纤维发酵分解成挥发性脂肪酸、氢气和二氧化碳等，而产生的二氧化碳、甲酸、乙 酸、甲胺和次甲胺等在甲烷生成菌的作用下合成甲烷。甲烷很难被自身消化利用，产生的甲 烷主要以嗳气的方式通过其口腔和鼻孔释放，肠道产生的甲烷约90%通过血液循环到肺部， 也是通过口腔排出，而其余10%的甲烷则由肛门排出。
[0004] 瘤胃内甲烷的调控主要通过卤代物及其衍生物、微生物调控和饲料添加剂的调 控。其中々化物及其类似化合物是反会动物体内CH4生成的有效抑制剂，如三氯乙烷、三氯 乙炔、溴氯甲烷等，均对产甲烷菌有毒害抑制作用，可抑制20%~80%的CH4产生。水合氯醛 在瘤胃中转化成氯仿，氯仿可以降低CH4的生成，但是水合氯醛损坏肝脏、长期饲喂会引起 动物中毒，甚至死亡，所以不运用于实际生产中。饲料添加剂则多含抗生素，在畜产品中产 生大量残留，对人体健康造成严重威胁，越来越多的消费者反对其在日粮中的使用。最为安 全与高效的则是微生物调控，瘤胃内微生物主要包括原虫、乙酸菌、甲烷氧化菌等。大量研 究表明甲烷氧化细菌能够以甲烷作为唯一碳源和能源进行生长，将甲烷(或甲基化合物）同 化为细胞碳，并在此过程中获得生长所需的碳源和能量。甲烷氧化菌氧化瘤胃内甲烷的途 径有两条，一条是通过由乙醛酸到丝氨酸的途径，另一条是甲醛结合在磷酸核糖上生成6- 磷酸阿洛酮糖的途径。通过甲烷氧化菌利用甲烷生长是减少反刍动物瘤胃及胃肠道甲烷排 放的一个重要途径。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是在奶牛粪便中分离出甲烷氧化菌的奶牛粪便中分离的甲烷氧化 菌及其分离方法。
[0006] 本发明的菌株，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC No.11836。
[0007] 本发明的菌剂，其活性成分为奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌表达菌株，CGMCC No.11836。
[0008] 本发明的奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，其培养基组成成分重量份为： 八液：1012?〇4〇.8~1.1、恥2册〇4.12!12〇2.8~3.0、]\%5〇4.7112〇0.30~0.34、（順4)23〇4 2 2.8~ 3.2； 微量元素 B液：MgS〇4.7H20 2.8~3.2、MnS〇4.2H20 0.3~0.6、Nacl 0.8~1.2、FeS〇4.7H20 0.08~1.02、CaCl2_2H200.08~1.02、ZnS04_7H200.08~1.02、CuS04_5H200.008~0.012、AlK (SO4)2 0.008-0.012^H3BO3 0.008-0.012^Na2MoO4-2H20 0.008-0.012； 将A液、B液按99:1的比例进行混合，作为甲烷氧化菌的无机盐培养基。
[0009 ]本发明的奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，其分离方法是： a、 样本采集:取奶牛场营养状况良好、无患病健康奶牛的新鲜粪便20g于含有200 ml 匪S培养基的无菌瓶中，充分震荡、混匀转移实验室备用； b、 取步骤a获得的混合液体充分振荡，用纱布过滤，以10%接种量接种，一次培养:取滤 液20 ml于含有200 ml灭菌NMS液体培养基的锥形瓶中，用橡胶塞塞紧密封，每天向培养瓶 中加入甲醇200 ul;摇床条件：170r/min、37°C空气摇床培养;二次培养:取上述菌液2 ml以 1%的接种量接种于新的含有200 ml灭菌NMS培养基的锥形瓶中，每天向培养瓶中加入甲醇 200 U1，用橡胶塞塞紧密封，空气摇床170r/min、37 °C以甲醇为唯一碳源进行培养;三次培 养:培养4-5天到达菌液对数生长期，取上述变粉菌液2 ml以1%的接种量接种于新的含有 200 ml灭菌NMS培养基的锥形瓶中，每天向培养瓶中加入甲醇200 ul，用橡胶塞塞紧密封， 空气摇床170r/min、37°C以甲醇为唯一碳源进行培养； c、 甲烷氧化菌的纯化培养： ⑴匪S固体培养基的制备:取配制好的匪S液体培养基与琼脂粉以1.5%~2%比例进行混 合，121°C高压蒸汽灭菌20min，将灭菌好的培养基在超净工作台中倒入玻璃平皿中，待平皿 中培养基凝固即为NMS固体培养基； ⑵甲烷氧化菌平板划线分离:取步骤b经过三次富集培养过程中处于对数期生长的甲 烷氧化菌菌液转移至灭菌的1.5ml离心管中，封盖备用；打开离心管，将无菌接种环伸入菌 液中，沾取一环菌液，打开平皿，将沾有菌液的接种环在固体培养基的第一区域上划三至五 条平行线;取新的无菌接种环，从第一区域划线的末端开始往第二区域划三至五条平行线； 如此重复以上操作在第三、第四、第五区域进行划线；划线完毕后将甲醇加至平皿盖，倒置 平皿放入37 °C恒温箱中培养，底部甲醇挥发为甲烷氧化菌生长提供碳源； d、 24小时候即生长出甲烷氧化菌。
[0010] 本发明的奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，菌液基因组DNA序列为SEQ ID N0:1。
[0011]本发明的奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，菌液基因组DNA的提取： ①取1~3 mL细菌培养液，12000g离心2分钟；倒掉培养基，加入180 yLTE缓冲液悬浮菌 体，加入18 yL 50mg/mL溶菌酶和5 yL RNA酶，30°C中静置15~30分钟；5000g离心5分钟，倒 掉上清，预留10 yL上清液；加入25 mg GlassBeads和200 yL Buffer TL，悬浮细胞，最大速 度涡漩5分钟，静置，使玻璃珠沉淀于管底，转移上清至1.5 mL离心管中；加入25 yL蛋白酶 K，涡漩10秒，瞬时离心；将混合液置于50°C振荡培养箱中温浴30分钟，如果没有振荡培养 箱，期间每隔2~3分钟瞬时涡漩一次以混匀；加入220 yL Buffer BL，涡漩混匀，65°C温浴10 分钟;加入220 yL无水乙醇，涡漩20秒混匀;将DNA吸附柱插入收集管中，转移所有混合液到 吸附柱中，1000 Og离心1分钟结合DNA，丢弃收集管和废液;将吸附柱放入另一收集管中，加 入500 yLBuffer KB，10000g离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；加入650 μ LDNAWashBuf f er，1000 Oxg离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；加入450 μ LDNAWashBuffer，1000 Og离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱放入新的收集管中；1000 Og开盖离 心2分钟以干燥吸附膜;将吸附柱放入1.5 mL离心管，加入50~100 yL预热的洗脱液(65°C)， 使吸附膜于65°C静置5分钟；1000 Oxg离心1分钟洗脱DNA;再次加入50~100 yL洗脱液，第2次 洗脱； ②聚合酶链式反应:用已提取的目的菌基因组总DNA为模板，用16S rDNA通用引物对目 的菌株的16S rDNA序列进行PCR扩增； 引物16SrDNA设计： 上游引物:5 ' ~AGAGTTTGATCATGGCTCAG~3 ' 下游引物：5 ' ~TACGGTTACCTTGTTACGACTT~3 ' PCR反应体系如下： 模板DNA Iul 上游引物 Iul 下游引物 Iul 2XTaq plus 12.5ul ddH20 9.5ul PCR反应条件： 95 °C 预变性 7min; 94 °C 变性 30s，58 °C 退火 30s，72 °C 延伸 40s; 30 个循环；72 °C 延伸 5min; PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外分析仪检测;利用凝胶回收试剂盒回收 纯化目的片段后与载体PGM-T连接，转化至大肠杆菌DH5a中，挑取单克隆，使用快速小提试 剂盒提取质粒，酶切鉴定正确后送检测序。
[0012] 奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，系统发育树的构建:将所测得的序列在NCBI上进 行比对，选取相关序列以ClustalW软件进行序列多重比对后，用MGE 5.1构建系统发育树。
[0013] 本发明的有益效果是： 1.甲烷氧化菌能够以温室气体甲烷作为碳源进行生长，对于减少甲烷产生即减少温室 效应具有一定作用。
[0014] 2.甲烷氧化菌能降解卤化碳氢化合物，在自然界碳循环和工业生物技术以及环境 治理中具有重要的应用价值。
[0015] 3.以甲烷氧化菌为主要成分制备益生菌制剂应用于临床，对于由反刍动物瘤胃发 酵引起的甲烷废气排放及动物摄入能量的浪费起到至关重要的作用。
【附图说明】
[0016] 图1是菌落形态图； 图2是革兰氏染色图； 图3是M17 16SrDNA扩增产物电泳图； 图4是系统发育树构建图； 图5是温度对甲烷氧化菌生长的影响曲线图； 图6是pH对甲烷氧化菌生长的影响曲线图； 图7是不同底物对甲烷氧化菌生长的影响柱状图； 图8是菌株在培养基中的生长规律曲线图。
【具体实施方式】
[0017] 本发明菌株，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC No.11836。
[0018] 保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号 保藏日期:2015年12月7日 保藏编号:CGMCC No. 11836 分类命名：甲基杆菌Methylobacterium sp. 〇
[0019] 本发明菌剂，其活性成分为奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌表达菌株，CGMCC No.11836。
[0020] 本发明奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，其培养基组成成分重量份为： 八液：1012?〇4〇.8~1.1、恥2册〇4.12!12〇2.8~3.0、]\%5〇4.7112〇0.30~0.34、（順4)23〇4 2 2.8~ 3.2； 微量元素 B液：MgS〇4.7H20 2.8~3.2、MnS〇4.2H20 0.3~0.6、Nacl 0.8~1.2、FeS〇4.7H20 0.08~1.02、CaCl2_2H200.08~1.02、ZnS04_7H200.08~1.02、CuS04_5H200.008~0.012、AlK (SO4)2 0.008-0.012^H3BO3 0.008-0.012^Na2MoO4-2H20 0.008-0.012； 将A液、B液按99 : 1的比例进行混合，作为甲烷氧化菌的无机盐培养基（Higgens nitrate minimal salt ，NMS)〇
[0021 ]本发明奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，其分离方法是： a、 样本采集:取奶牛场营养状况良好、无患病健康奶牛的新鲜粪便20g于含有200 ml 匪S培养基的无菌瓶中，充分震荡、混匀转移实验室备用； b、 取步骤a获得的混合液体充分振荡，用纱布过滤，以10%接种量接种，一次培养:取滤 液20 ml于含有200 ml灭菌NMS液体培养基的锥形瓶中，用橡胶塞塞紧密封，每天向培养瓶 中加入甲醇200 u 1 (甲醇的最佳添加量为0.05~0.1%，V/V)，确保培养瓶中甲醇的量能够维 持甲烷氧化菌对于甲醇的消耗，即以甲醇为唯一碳源进行富集培养。摇床条件：170r/min、 37 °C空气摇床培养;培养4-5天时菌液变浑池，因为第一次接种时还残留样本中的杂质，所 以并没有很明显的颜色变化。二次培养:取上述菌液2 ml以1%的接种量接种于新的含有200 ml灭菌匪S培养基的锥形瓶中，每天向培养瓶中加入甲醇200 ul，用橡胶塞塞紧密封，空气 摇床170r/min、37°C以甲醇为唯一碳源进行培养;培养1天后菌液变浑浊，培养2-3天后菌液 由浑浊变为浅粉色，当培养4-5天时甲烷氧化菌达到对数期生长，菌液由浅粉变为深粉色。 三次培养:培养4-5天到达菌液对数生长期，且菌液颜色变为深粉色时，取上述变粉菌液2 ml以1%的接种量接种于新的含有200 ml灭菌NMS培养基的锥形瓶中，每天向培养瓶中加入 甲醇200 ul，用橡胶塞塞紧密封，空气摇床170r/min、37°C以甲醇为唯一碳源进行培养； C、甲烷氧化菌的纯化培养： ⑴匪S固体培养基的制备:取配制好的匪S液体培养基与琼脂粉以1.5%~2%比例进行混 合，121°C高压蒸汽灭菌20min，将灭菌好的培养基在超净工作台中倒入玻璃平皿中，待平皿 中培养基凝固即为NMS固体培养基； ⑵甲烷氧化菌平板划线分离:取步骤b经过三次富集培养过程中处于对数期生长的甲 烷氧化菌菌液转移至灭菌的1.5ml离心管中，封盖备用；打开离心管，将无菌接种环伸入菌 液中，沾取一环菌液，打开平皿，将沾有菌液的接种环在固体培养基的第一区域上划三至五 条平行线。取新的无菌接种环，从第一区域划线的末端开始往第二区域划三至五条平行线。 如此重复以上操作在第三、第四、第五区域进行划线。划线过程中注意不要划破培养基，从 上一区域划线末端向下一新的区域划线时需更换新的无菌接种环且最后一个区域的划线 不能与第一区域相连。划线完毕后将甲醇加至平皿盖，倒置平皿放入37°C恒温箱中培养，底 部甲醇挥发为甲烷氧化菌生长提供碳源。
[0022] d、24小时候即生长出甲烷氧化菌。
[0023]甲烷氧化菌的鉴定： 形态学观察 将分离得到的甲烷氧化菌菌株用平板划线的方法在平板上37°C恒温培养96 h左右，观 察平板上的菌落形态、颜色、透明度、菌落边缘隆起情况等。
[0024] 理化性质鉴定 革兰氏染色：首先将经过适当培养的菌液进行涂片和固定。用草酸铵结晶紫染液染 Imin，水洗，滴加卢氏碘液冲去残水并覆盖约Imin，水洗并吸干水分。滴加95%的酒精，脱色， 至流下的酒精刚刚不出现紫色为止，立即水洗。再用番红复染液染色1~2min，水洗。干燥后 油镜。
[0025]甲基红试验:将菌株接种于甲基红试验培养基，于37 °C恒温培养箱培养。48~72h后 取培养液加入干净试管，然后加入甲基红试剂1~2滴，观察培养液颜色变化，呈现红色为阳 性，淡红色为弱阳性，黄色为阴性。
[0026]产H2S试验：将菌株接种于硫化氢试验培养基，于37 °C恒温培养箱培养48~72h。观 察培养基颜色变化，若变黑色为阳性反应，反之为阴性反应。
[0027]接触酶试验：将菌种用接种环取少许涂于已滴有3%过氧化氢的玻片上，如有气泡 产生则 为阳性，无气泡为阴性。
[0028]柠檬酸盐利用试验:将菌株接种于柠檬酸盐培养基，于37 °C恒温培养箱培养。48h 后观察结果，若培养基上长出菌苔且培养基变蓝色即为阳性;无菌生长、培养基为绿色则为 阴性。
[0029] 靛基质（吲哚)试验:将菌株接种于吲哚试验培养基，于37°C恒温培养箱培养。48 h 后取培养液加入干净试管，然后加入乙醚，充分振荡后沿管壁缓缓滴加吲哚试剂5~10滴，有 红色环出现则为阳性，反之则为阴性。
[0030] 淀粉水解试验:取适当培养的菌种点接于淀粉水解培养基平板上，于37°C恒温培 养箱培养24 h。取出平板打开平皿盖，在平板上滴加卢氏碘液，使碘液均匀铺满整个平板。 若菌落周围出现无色透明圈，则说明淀粉已经被水解，表示该菌具有分解淀粉的能力，即为 阳性;若仍然为兰黑色则说明淀粉没被水解，为阴性。
[0031]明胶液化试验:将菌株穿刺接种于明胶培养基，20°C培养7天，逐日观察明胶液化 现象。若室温较高导致明胶液化则观察前将培养基置于4°C冰箱30 min后取出观察。若培养 基仍呈液化状态则为阳性，反之则是阴性。
[0032] 本发明奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，菌液基因组DNA序列为SEQ ID NO: 1。
[0033]由哈尔滨博仕生物技术有限公司完成目的菌株的16SrDNA部分序列测序，釆用 BLAST软件在GeneBank上进行同源性比较。
[0034]本发明奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，菌液基因组DNA的提取： ① 取1~3 mL细菌培养液，12000g离心2分钟；倒掉培养基，加入180 yLTE缓冲液悬浮菌 体，加入18 yL 50mg/mL溶菌酶和5 yL RNA酶，30°C中静置15~30分钟；5000g离心5分钟，倒 掉上清，预留10 yL上清液；加入25 mg GlassBeads和200 yL Buffer TL，悬浮细胞，最大速 度涡漩5分钟，静置，使玻璃珠沉淀于管底，转移上清至1.5 mL离心管中；加入25 yL蛋白酶 K，涡漩10秒，瞬时离心；将混合液置于50°C振荡培养箱中温浴30分钟，如果没有振荡培养 箱，期间每隔2~3分钟瞬时涡漩一次以混匀；加入220 yL Buffer BL，涡漩混匀，65°C温浴10 分钟;加入220 yL无水乙醇，涡漩20秒混匀;将DNA吸附柱插入收集管中，转移所有混合液到 吸附柱中，1000 Og离心1分钟结合DNA，丢弃收集管和废液;将吸附柱放入另一收集管中，加 入500 yLBuffer KB，10000g离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；加入650 μ LDNAWashBuf f er，1000 Oxg离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；加入450 μ LDNAWashBuffer，1000 Og离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱放入新的收集管中；1000 Og开盖离 心2分钟以干燥吸附膜;将吸附柱放入1.5 mL离心管，加入50~100 yL预热的洗脱液(65°C)， 使吸附膜于65°C静置5分钟；1000 Oxg离心1分钟洗脱DNA;再次加入50~100 yL洗脱液，第2次 洗脱； ② 聚合酶链式反应:用已提取的目的菌基因组总DNA为模板，用16S rDNA通用引物对目 的菌株的16S rDNA序列进行PCR扩增； 引物16SrDNA设计： 上游引物:5 ' ~AGAGTTTGATCATGGCTCAG~3 ' 下游引物：5 ' ~TACGGTTACCTTGTTACGACTT~3 ' PCR反应体系如下： 模板DNA Iul 上游引物 Iul 下游引物 Iul 2XTaq plus 12.5ul ddH20 9.5ul PCR反应条件： 95 °C 预变性 7min; 94 °C 变性 30s，58 °C 退火 30s，72 °C 延伸 40s; 30 个循环；72 °C 延伸 5min; PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外分析仪检测;利用凝胶回收试剂盒回收 纯化目的片段后与载体PGM-T连接，转化至大肠杆菌DH5a中，挑取单克隆，使用快速小提试 剂盒提取质粒，酶切鉴定正确后送检测序。
[0035]本发明奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，系统发育树的构建：将所测得的序列在 NCBI上进行比对，选取相关序列以ClustalW软件进行序列多重比对后，用MAGE 5.1构建系 统发育树。
[0036]不同温度、PH、底物对甲烷氧化菌生长的影响： 温度对甲烷氧化菌生长的影响： 将甲烷氧化菌Ml7接种于液体培养基，设定温度在20 °045 °C之间，每5 °C为一个梯度进 行培养，96 h后测定各个温度梯度内甲烷氧化菌生长的OD值。
[0037] pH对甲烷氧化菌生长的影响： 将甲烷氧化菌Ml 7接种于液体培养基，设定pH分别为4、5、6、7、8、9、10，37 °C恒温培养箱 培养96 h后，测定各个PH梯度内甲烷氧化菌生长的OD值。
[0038]不同底物对甲烷氧化菌生长的影响 分别用麦芽糖，蔗糖，葡萄糖，淀粉，甲醇作为碳源，每天加入定量上述碳源于液体培养 基，37°C恒温培养箱培养96h后测定不同底物培养条件下甲烷氧化菌的OD值。
[0039]菌株在培养基中的生长规律： 在570 nm波长处测菌体培养液的OD值。以1%的接种量把甲烷氧化菌接入到培养瓶中， 通入I: I (v/v)的空气和甲烷气体。37°C摇床培养，每隔24 h在570 nm波长处测菌液的OD值。
[0040] 试验结果 1、甲烷氧化菌的筛选 将纯化培养得到的不同单一菌株接种到液体培养基中，通入10%甲烷气体，37°C气浴摇 床培养，分别在3天和7天后测定培养瓶中甲烷气体含量，根据其对甲烷的消耗率从而得到 氧化甲烧能力最强的目的菌株，命名为Ml 7。
[0041] 2、甲烷氧化菌的鉴定 2.1生理生化鉴定 菌株在平板培养基上形成隆起的短矩形菌落，表面光滑，灰白色半透明状，较湿润，直 径较小约0.5~Imm左右。在显微镜下观察，其个体形态呈短杆状，革兰氏染色阴性（图1和图 2)。产H2S试验、吲哚试验为阴性；甲基红试验、接触酶试验、柠檬酸盐利用试验、淀粉水解试 验、明胶液化试验为阳性。
[0042] 表1甲院氧化菌M17的生理生化特征
2.2分子生物学鉴定 (1)菌株M17的16SrDNA的序列扩增及测定 提取菌株M17的基因组DNA，以细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增后，扩增产物使用琼 脂糖电泳分析，结果如图3所示。
[0043] PCR产物经凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段后与载体PGM-T连接，转化至大肠杆 菌DH5a中，挑取单克隆，使用快速小提试剂盒提取质粒，酶切鉴定正确后送检测序，共 IlOlbp，SEQ ID NO:1。
[0044] 采用BLAST软件在GeneBank上对菌株M17的16SrDNA序列进行同源性比较，发现M17 的 16SrDNA序列与甲基杆菌属（Methylobacterium radiotolerans JCM plasmid pMRAD)关 系最紧密。
[0045] (2)构建系统发育树 将所测得的序列在NCBI上进行比对，调出GenBank中已鉴定菌株的相似种属16S rDNA 序列，以ChistalW进行序列多重比对后，用MGE 5.1构建系统发育树，如图4所示。
[0046]不同温度、PH、底物对甲烷氧化菌生长的影响 温度对甲烷氧化菌生长的影响： 将甲烷氧化菌M17接种于液体培养基，分别于温度为20°O45°C的培养箱中培养，每5°C 为一个梯度，96 h后测定其OD值，如图5所示，甲烷氧化菌Ml7的最适生长温度在35°〇40°C 之间。
[0047] pH对甲烷氧化菌生长的影响： 将甲烷氧化菌Ml 7接种pH分别为4、5、6、7、8、9、10的液体培养基，于37 °C恒温培养96 h 后，测定甲烷氧化菌OD值，如图6所示，结果表明菌株在PH =7.0时生长最为良好。
[0048]不同底物对甲烷氧化菌生长的影响 分别用麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、甲醇作为碳源，每天加入定量上述碳源于液体培养 基，37°C培养96 h后测其OD值，如图7所示，甲烷氧化菌能够以甲醇、麦芽糖、蔗糖和葡萄糖 为碳源较好的生长，其中对于甲醇的利用效果最为明显，而以淀粉作为碳源时生长缓慢或 不生长。
[0049]菌株在培养基中的生长规律:（图8) 在570 nm波长处测菌体培养液的OD值。以1%的接种量把甲烷氧化菌接入到培养瓶中， 通入I: I (v/v)的空气和甲烷气体。37°C恒温摇床培养，每隔24 h在570 nm波长处测菌体的 OD值。
【主权项】
1. 一种奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌菌株，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心保藏号为CGMCC No.11836。2. -种菌剂，其活性成分为奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌表达菌株，CGMCC No. 11836。3. 权利要求1所述奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，其特征在于:其培养基组成成分重量 份为： 八液：1012?〇4〇.8~1.1、似2册〇4.12!12〇2.8~3.0、]\%5〇4.7112〇0.30~0.34、（順4)23〇4 2 2.8~ 3.2； 微量元素 B液：MgS〇4.7H20 2.8~3.2、MnS〇4.2H20 0.3~0.6、Nacl 0.8~1.2、FeS〇4.7H20 0.08~1.02、CaCl2_2H20 0.08~1.02、ZnS〇4_7H20 0.08~1.02、CuS〇4_5H20 0.008~0·012、Α1Κ (S〇4)2 0.008~0·012、Η3Β〇3 0.008~0.012、Na2Mo〇4_2H2〇 0.008~0.012; 将A液、B液按99:1的比例进行混合，作为甲烷氧化菌的无机盐培养基。4. 权利要求1所述奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，其特征在于:其分离方法是： a、 样本采集：取奶牛场营养状况良好、无患病健康奶牛的新鲜粪便20g于含有200 ml 匪S培养基的无菌瓶中，充分震荡、混匀转移实验室备用； b、 取步骤a获得的混合液体充分振荡，用纱布过滤，以10%接种量接种，一次培养:取滤 液20 ml于含有200 ml灭菌NMS液体培养基的锥形瓶中，用橡胶塞塞紧密封，每天向培养瓶 中加入甲醇200 ul;摇床条件：170r/min、37°C空气摇床培养;二次培养:取上述菌液2 ml以 1%的接种量接种于新的含有200 ml灭菌NMS培养基的锥形瓶中，每天向培养瓶中加入甲醇 200 U1，用橡胶塞塞紧密封，空气摇床170r/min、37 °C以甲醇为唯一碳源进行培养;三次培 养:培养4-5天到达菌液对数生长期，取上述变粉菌液2 ml以1%的接种量接种于新的含有 200 ml灭菌NMS培养基的锥形瓶中，每天向培养瓶中加入甲醇200 ul，用橡胶塞塞紧密封， 空气摇床170r/min、37°C以甲醇为唯一碳源进行培养； c、 甲烷氧化菌的纯化培养： ⑴匪S固体培养基的制备：取配制好的匪S液体培养基与琼脂粉以1.5%~2%比例进行混 合，121°C高压蒸汽灭菌20min，将灭菌好的培养基在超净工作台中倒入玻璃平皿中，待平皿 中培养基凝固即为NMS固体培养基； ⑵甲烷氧化菌平板划线分离：取步骤b经过三次富集培养过程中处于对数期生长的甲 烷氧化菌菌液转移至灭菌的1.5ml离心管中，封盖备用；打开离心管，将无菌接种环伸入菌 液中，沾取一环菌液，打开平皿，将沾有菌液的接种环在固体培养基的第一区域上划三至五 条平行线;取新的无菌接种环，从第一区域划线的末端开始往第二区域划三至五条平行线； 如此重复以上操作在第三、第四、第五区域进行划线；划线完毕后将甲醇加至平皿盖，倒置 平皿放入37 °C恒温箱中培养，底部甲醇挥发为甲烷氧化菌生长提供碳源； d、 24小时候即生长出甲烷氧化菌。5. 权利要求1所述奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，其特征在于:菌液基因组DNA序列为 SEQ ID N0:1。6. 权利要求5所述奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，其特征在于:菌液基因组DNA的提取： ①取1~3 mL细菌培养液，12000g离心2分钟；倒掉培养基，加入180 yLTE缓冲液悬浮菌 体，加入18 yL 50mg/mL溶菌酶和5 yL RNA酶，30°C中静置15~30分钟；5000g离心5分钟，倒 掉上清，预留10 yL上清液；加入25 mg GlassBeads和200 yL Buffer TL，悬浮细胞，最大速 度涡漩5分钟，静置，使玻璃珠沉淀于管底，转移上清至1.5 mL离心管中；加入25 yL蛋白酶 K，涡漩10秒，瞬时离心；将混合液置于50°C振荡培养箱中温浴30分钟，如果没有振荡培养 箱，期间每隔2~3分钟瞬时涡漩一次以混匀；加入220 yL Buffer BL，涡漩混匀，65°C温浴10 分钟;加入220 yL无水乙醇，涡漩20秒混匀;将DNA吸附柱插入收集管中，转移所有混合液到 吸附柱中，l〇〇〇〇g离心1分钟结合DNA，丢弃收集管和废液;将吸附柱放入另一收集管中，加 入500 yLBuffer KB，10000g离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；加入650 μ LDNAWashBuf f er，lOOOOxg离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中；加入450 μ LDNAWashBuffer，10000g离心1分钟，倒掉废液，将吸附柱放入新的收集管中；10000g开盖离 心2分钟以干燥吸附膜;将吸附柱放入1.5 mL离心管，加入50~100 yL预热的洗脱液(65°C)， 使吸附膜于65°C静置5分钟；lOOOOxg离心1分钟洗脱DNA;再次加入50~100 yL洗脱液，第2次 洗脱； ②聚合酶链式反应：用已提取的目的菌基因组总DNA为模板，用16S rDNA通用引物对目 的菌株的16S rDNA序列进行PCR扩增； 引物16SrDNA设计： 上游引物:5 ' ~AGAGTTTGATCATGGCTCAG~3 ' 下游引物：5 ' ~TACGGTTACCTTGTTACGACTT~3 ' PCR反应体系如下： 模板DNA lul 上游引物 lul 下游引物 lul 2 XTaq plus 12.5ul ddH20 9.5ul PCR反应条件： 95°C 预变性 7min;94°C 变性 30s，58°C 退火 30s，72°C 延伸 4〇8;30个循环；72°(：延伸51^11; PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外分析仪检测;利用凝胶回收试剂盒回收 纯化目的片段后与载体PGM-T连接，转化至大肠杆菌DH5a中，挑取单克隆，使用快速小提试 剂盒提取质粒，酶切鉴定正确后送检测序。7.权利要求5所述奶牛粪便中分离的甲烷氧化菌，其特征在于：系统发育树的构建:将 所测得的序列在NCBI上进行比对，选取相关序列以ClustalW软件进行序列多重比对后，用 MAGE 5.1构建系统发育树。
【文档编号】C12R1/01GK105861353SQ201610012765
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年1月11日
【发明人】刘国文, 刘欢, 李心慰, 王哲, 李小兵, 赵晨旭
【申请人】吉林大学