一种蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法
【专利摘要】本发明公开一种蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法。该方法的步骤如下：选择蛋鸭，颈静脉放血处死，分别用新洁尔灭稀释液和酒精两次身体消毒，分离卵巢中3～8mm卵泡；剥离卵泡外层血管和结缔组织，固定卵泡，排出卵黄，剥离颗粒细胞层，清洗后离心弃上清，加入酶解溶液消化、过筛，M199培养基清洗，离心弃上清；加入红细胞裂解液，离心弃上清；加入含有胎牛血清的M199培养基，悬浮颗粒细胞，调整悬浮液细胞密度，接种培养，得蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞。本发明的方法不仅适用于鸭的大黄卵泡中颗粒细胞的分离，还适用于小黄卵泡颗粒细胞的分离；且颗粒细胞纯度高、活力好、细胞功能稳定；同时具有操作简单、易重复、结果稳定等优点。
【专利说明】
一种蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法。
【背景技术】
[0002]近年来，全国尤其是南方地区蛋鸭养殖数量逐渐增长，蛋鸭养殖对家禽产业经济效益具有重要贡献。蛋鸭是一种高产蛋禽，年产蛋数量在300枚左右。研究发现，卵泡的成熟排卵是决定蛋鸭产蛋数的关键因素。家禽中卵泡的发育主要经历原始卵泡—初级卵泡—次级卵泡三个过程。但在鸭卵泡发育过程中存在着竞争性，?0.1 %卵泡能正常发育成熟，99%卵泡由于细胞发生凋亡而出现卵泡闭锁现象，不能发育成熟和排卵。在卵泡发育过程中，蛋鸭卵泡建立了严格的等级体系，其中直径6?8mm阶段卵泡是决定蛋鸭卵泡成熟排卵的关键阶段。卵泡发育的竞争性受到多种因素的影响，大量研究显示，卵巢中颗粒细胞对卵泡的发育起着决定性作用。颗粒细胞是卵泡中位于卵母细胞周围的一层柱状细胞，其主要生物学功能是为卵母细胞提供营养物质，并合成和分泌类固醇激素(如孕酮等)，从而调控卵泡发育成熟及排卵。研究表明，颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的重要原因，其功能决定着卵泡的发育与成熟，并最终影响蛋禽的产蛋性能。因此，建立原代颗粒细胞体外培养模型是探索家禽卵巢卵泡发育机制的重要途径。而目前，家禽中原始卵泡中颗粒细胞的方法仅仅局限于鹅、鸡的报道。由于鸭的生理代谢等方面不同于鸡和鹅，一些原代细胞的培养分离方法尚未建立，值得进一步研究。针对该问题，本研究摈弃了其他家禽所常采用大黄卵泡(直径>10mm)提取颗粒细胞的方法，而采用直径3?5mm及6?8mm这一决定卵泡发育的关键阶段卵泡，来进行颗粒细胞分离，对研究蛋鸭颗粒细胞参与卵泡成熟调控提供技术支撑。
【发明内容】
[0003]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法。本发明解决了尚未建立的蛋鸭卵泡原代颗粒细胞分离培养方法的问题。
[0004]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0005]—种蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，包括如下步骤:
[0006](I)选择160?300日龄蛋鸭，保定后对其进行颈静脉放血处死；
[0007](2)将处死鸭浸泡在新洁尔灭稀释液中I?3min，洗净，用经高温高压灭菌的纱布拭干多余新洁尔灭，转移；
[0008](3)用75%酒精喷洒鸭后，立即转移到超净台中；
[0009](4)剪开皮肤层和肌肉层，分离卵巢组织;按不同大小卵泡进行分离，放置在预冷的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中；
[0010](5)分离单个卵泡后，测量卵泡直径后分级，分别转移到PBS中；
[0011](6)选择直径在3?8mm范围内的卵泡；
[0012](7)轻轻去除卵泡外层血管与结缔组织；
[0013](8)固定卵泡后，将卵泡剪开，迅速挤压卵泡，排出卵黄，得到卵泡膜；
[0014](9)转移卵泡膜放置预冷PBS中，将卵泡膜内侧朝上，分离颗粒细胞层；
[0015](10)将混有颗粒细胞层的液体转移，剪碎，收集；
[0016](11)4°C，800?100rpm离心8?12min，弃上清；
[0017](12)加入酶解溶液，吹打3?6次后转移到平底玻璃消化瓶中，37°C，70?90rpm，振荡孵育20?25min;
[0018](13)加入胎牛血清(使终浓度达到10 % )终止消化，轻轻吹打1?20次；
[0019](14)转移含有颗粒细胞的消化液过不锈钢细胞网筛，并用M199培养基冲洗网筛；
[0020](15)收集过筛细胞液，800 ?1000印111，4°(^离心8?12111；[11;
[0021 ] (16)弃上清，加入红细胞裂解液，室温静置3?8min，800?100rpm，4 °C离心8?12min；
[0022](17)弃上清，加入无血清M199培养基清洗细胞I?2次，800?1000rpm，4°C离心8?12min；
[0023](18)弃上清，加入含有胎牛血清(使终浓度为5%)的M199培养基，悬浮颗粒细胞，使得细胞密度在I X 16-1 X 17个/mL，得到颗粒细胞悬液；
[0024](19)加入颗粒细胞悬液到细胞培养皿中，转移至恒温二氧化碳(5%)细胞培养箱37°C或39°C培养；
[0025](20)颗粒细胞培养24小时后，换新鲜含有5%胎牛血清的M199培养基，贴壁细胞为蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞。
[0026]步骤(2)中所述的新洁尔灭稀释液按照新洁尔灭与超纯水的体积比为1:49配制；
[0027]所述的PBS溶液配制方法是:超纯水中，磷酸二氢钾0.2g/L、氯化钠8g/L、氯化钾0.2g/L、磷酸氢二钠1.15g/L，调pH为7.4，121°C高温高压灭菌20min，4°C保存。
[0028]步骤(12)中所述的酶解溶液的配制方法是:M199培养基中，添加有5.72g/L的HEPES，I%PeniciIIin-Streptomycin-Neomycin(PSN)Antib1tic Mixture,0.3% Π 型胶原酶。
[0029]步骤(14)中所述的不锈钢细胞网筛为200目的不锈钢细胞网筛。
[0030]本发明是针对蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞分离培养而设计的方法。
[0031]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果:
[0032 ] (I)本发明不仅适用于鸭的小黄卵泡中颗粒细胞的分离，还适用于其他等级卵泡(如大白卵泡、大黄卵泡等)中颗粒细胞的分离。
[0033](2)采用本发明分离的培养鸭原代颗粒细胞纯度高、活力好、细胞功能稳定。
[0034](3)本发明的方法具有操作简单、易重复、结果稳定等优点。
【附图说明】
[0035]图1是实施例1蛋鸭3?5mm卵泡颗粒细胞在显微镜下的结果图；其中，图1A、B、C中是鸭颗粒细胞分离培养24h、48h和72h的结果图。
[0036]图2是实施例2蛋鸭6?8mm卵泡颗粒细胞在显微镜下的结果图；其中，图2A、B、C中是鸭颗粒细胞分离培养24h、48h和72h的结果图。
[0037]图3是实施例1蛋鸭3?5mm卵泡颗粒细胞免疫荧光FITC鉴定图；其中，图3A、B、C中是颗粒细胞的FITC特异性荧光、Hoechst核染、FITC与核染荧光的重合的结果图。
[0038]图4是实施例2蛋鸭6?8mm卵泡颗粒细胞免疫荧光FITC鉴定图；其中图4A、B、C中是颗粒细胞的FITC特异性荧光、Hoechst核染、FITC与核染荧光的重合的结果图。
【具体实施方式】
[0039]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0040]若未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售分析纯试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0041 ]仪器与试剂
[0042]200目不锈钢细胞网筛(广州穗埔生金属筛网有限公司，中国)，水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司，中国)，超净台(Airtech，美国)，恒温细胞培养箱(Thermo Fisher，美国)，6cm细胞培养皿(Nunc dish,Thermo,中国)，眼科镊(上海医疗器械有限公司手术器械厂，中国)，玻璃吸管(海门弘澄实验器材制造厂，中国)，离心机(Eppendorf，德国)、倒置荧光显微镜(Olympus，日本)，Ml99培养基(Invitrogen，美国)，胎牛血清(ExCe11，美国)，Penicillin-Streptomycin-Neomycin(PSN)Antib1tic Mixture(Gibco，美国)，II型胶原酶(Sigma，美国)，红细胞裂解液(康为世纪，中国)，Hoechst 33342(碧云天，中国)，多聚甲醛(上海国药，中国),Triton X_100(碧云天，中国)，封闭液(碧云天，中国)，Tween_20(碧云天，中国)，FSHR抗体(Abcam，英国)，二抗IgG( Invitrogen，美国)，游标卡尺(上海申工，中国)，恒温摇床(Eppendor，德国)，移液器(Eppendorf，德国)。
[0043]实施例1
[0044](I)选择172日龄产蛋期蛋鸭，用毛剪剪掉腹部羽毛和绒毛，颈部静脉放血处死，用灭菌水清洗伤口，并用新洁儿灭稀释液(1:49)清洗全身2min，用灭菌干抹布擦干身体，送入到细胞培养室中，用75 % (v/v)酒精喷洒全身，转入超净台内。
[0045](2)依次分离外层皮肤、肌肉层，剥离卵巢周围膜组织，用钝型镊子分离并剪掉卵巢，取出整个卵巢组织和卵泡，放入到装有PBS的烧杯中。
[0046](3)采用游标卡尺对卵泡直径度量分级后，将直径3?5_小黄卵泡用眼科剪分离，并转移到装有PBS的12cm大小灭菌培养皿中。
[0047](4)用眼科镊剥离卵泡结缔和血管组织后，固定卵泡，采用一次性ImL注射器针头扎破卵泡，并用镊子轻轻从破口处朝相反方向撕开，待内容卵黄自然流出后，用镊子将剩余卵泡部分小心转移到装有PBS的灭菌的12cm培养皿中。
[0048](5)在PBS溶液中，可见白色层颗粒细胞与卵泡膜粘连，轻轻晃动卵泡后，用镊子小心剥离颗粒层细胞，保留在PBS溶液中，弃卵泡膜。
[0049](6)将培养皿中含有颗粒细胞的PBS转移到15mL离心管中，1000rpm，4°C离心1min0
[0050](7)弃上清，加入5mL酶解溶液(所述的酶解溶液的配制方法是:Ml99培养基中，添加有 5.72g/L 的 HEPES，l%Penicill in-Strep tomycin-Neomyc in (PSN) Antibi oticMixture,0.3% Π型胶原酶)，混匀，转移到50mL的平底玻璃消化瓶中，封口，在摇床中37°C消化20min，恒温箱震荡速度70?90rpm。
[0051 ] (8)在消化瓶中加入0.5mL胎牛血清，终止消化。
[0052](9)用玻璃吸管轻轻吹打消化后的细胞溶液10次，将含有颗粒细胞的消化液过200目不锈钢细胞网筛，并用Ml 99培养基清洗网筛。
[0053](10)转移过滤后的颗粒细胞溶液到15mL离心管中，1000rpm，4°C离心lOmin，弃上清液，加入红细胞裂解液ImL，移至1.5mL离心管中，轻轻吹打，静置5min，100rpm，4°C离心1min，弃上清液，加入M199培养基5mL，再次悬浮、离心，弃上清液。
[0054](11)加入含有胎牛血清的M199培养基，悬浮颗粒细胞，测定细胞密度，调整悬浮液细胞密度为I X 16个/mL，得到颗粒细胞悬浮液，加入3mL颗粒细胞悬浮液接种到6cm培养皿中培养。
[0055](12)转移培养皿至恒温培养箱中，37°C，5%C02。
[0056](13)颗粒细胞培养24小时后，换新鲜含有胎牛血清的M199培养基，贴壁细胞为蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞。
[0057]上述PBS溶液配制方法是:每升超纯水加磷酸二氢钾0.2g;氯化钠Sg;氯化钾0.2g;磷酸氢二钠1.15g，调pH为7.4，高温高压灭菌20111；[11，4°(:保存。
[0058]上述步骤所述含有胎牛血清的M199培养基是:含有5%胎牛血清的M199培养基，百分比为体积比。
[0059]实施例2
[0060](I)选择185日龄健康蛋鸭，颈静脉放血处死，用灭菌蒸馏水清洗伤口，用新洁尔灭稀释液(I:49)清洗全身消毒，后用灭菌抹布擦干，放托盘中，转移到细胞室中。
[0061](2)用75% (v/v)酒精喷洒鸭全身，转移至超净台内。
[0062](3)用手术剪分离皮肤层、肌肉层及卵巢周围膜组织，采用镊子与手术剪将位于鸭机体左侧的完整卵巢及卵泡分离，转移到装有PBS的50mL灭菌烧杯中。
[0063](4)用手术剪分离所有小黄卵泡，并用游标卡尺测量卵泡直径后进行分级，选择直径6?8mm的小黄卵泡，转移到装有PBS的12cm灭菌玻璃培养皿中。
[0064](5)用眼科镊轻轻分离卵泡外层的结缔与血管组织，用镊子固定卵泡，用一次性医用2mL注射器针头扎破卵泡，同时用另一只镊子将卵泡破口撕开，让卵泡内蛋白类物质自然银LU
LU ο
[0065](6)小心转移剩余卵泡膜至另一装有PBS的灭菌培养皿中，用镊子轻轻夹住白色片状颗粒细胞，剥离后留在PBS溶液中，丢弃剩余卵泡膜。
[0066](7)用5mL移液器转移含有颗粒细胞的I3BS溶液到15mL试管中，4°C，1000rpm，离心1min0
[0067](8)弃上清液，加入1mL酶解溶液(所述的酶解溶液的配制方法是:M199培养基中，添加有5.72g/L HEPES , I %Penicil I in-Streptomycin-Neomyc in (PSN) Antib1ticMixture，0.3% Π型胶原酶)。悬浮混匀，转移到50mL平底玻璃消化瓶中，封口，在恒温摇床中 37°C，80rpm，消化20min。
[0068](9)加入ImL胎牛血清至消化液中，终止消化，玻璃吸管反复吹打10次。
[0069](10)用移液器将含有颗粒细胞的消化液转移过200目不锈钢细胞网筛，并用2mL无血清Ml 99培养基清洗网筛。
[0070](11)转移含有颗粒细胞的消化液至15mL离心管中，4°C 100rpm，离心1min。
[0071](12)弃上清，加入红细胞裂解液lmL，移至1.5mL离心管中，轻轻吹打，静置5min，I OOOrpm，4 °C 离心 I Omin。
[0072](13)弃上清，加入1mL M199培养基，悬浮后，4°C1000rpm，离心lOmin。
[0073](14)弃上清，加入含有胎牛血清的M199培养基，悬浮颗粒细胞，测定细胞密度，调整悬浮液细胞密度为I X 16个/mL，得到颗粒细胞悬浮液，加入3mL颗粒细胞悬浮液到6cm培养皿中培养。
[0074](15)转移培养皿至恒温培养箱中，37°C，5%C02。
[0075](16)颗粒细胞培养24小时后，换新鲜含有胎牛血清的M199培养基，贴壁细胞为蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞。
[0076]上述PBS溶液配制方法是:每升超纯水加磷酸二氢钾0.2g;氯化钠Sg;氯化钾0.2g;磷酸氢二钠1.15g，调pH为7.4，高温高压灭菌20111；[11，4°(:保存。
[0077]上述步骤所述含有胎牛血清的M199培养基是:含有5%胎牛血清的M199培养基，百分比为体积比。
[0078]颗粒细胞形态学观测
[0079]细胞培养后，每天在倒置显微镜下观测细胞形态，拍照，记录每个时间点细胞形态及生长情况。
[0080]颗粒细胞免疫荧光鉴定
[0081 ] (I)颗粒细胞培养48h后，PBS漂洗3次，每次3min。
[0082](2)细胞固定在4.0%福尔马林溶液中20min。
[0083](3)PBS 洗涤 3 次，每次 3min。
[0084](4)用0.2%Triton X-100透化 10min(37°C)。
[0085](5)PBS 洗涤 3 次，每次 3min。
[0086](6)用5%BSA 封闭30min。
[0087](7)用FSHR抗体进行标记(按照8yg/mL的比例稀释在I %BSA中)，室温下孵育4°C条件下过夜。
[0088](8)PBS进行清洗3次，每次3min。
[0089](9)用含有二抗IgG的溶液(兔抗IgG生物素抗体，1:1OOO的比例I % BSA稀释)进行室温度孵育Ih。
[0090](10)细胞核染色用Hoechstd:10000)染色2min，用PBS洗涤3次，每次4min。
[0091 ] (11)晾干封片，荧光显微镜观察拍照，用显微镜条件为:Hoechst荧光(激发波长450nm/发射波长461nm)，FITC荧光(激发波长494nm/发射波长518nm)。
[0092 ] (12)镜检观察，表达FSHR蛋白的细胞发红光。
[0093]实验结果
[0094](I)蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的形态学观察。
[0095]在倒置显微镜下观测发现，颗粒细胞在刚分离培养24h时，细胞形态具有不规则型。培养48h颗粒细胞数量进一步增长。培养72h后，细胞呈梭形。颗粒细胞培养72h后虽然形态发生变化，但应用免疫荧光鉴定发现，培养的细胞为颗粒细胞。
[0096I 倒置荧光显微镜下观测，在颗粒细胞核经Hoechst染色后，呈现蓝色荧光。
[0097]实施例1得到的蛋鸭3?5mm卵泡颗粒细胞在显微镜下的观测结果如图1所示。
[0098]实施例2得到的蛋鸭6?8mm卵泡颗粒细胞在显微镜下的观测结果如图2所示。
[0099](2)蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞免疫荧光鉴定
[0100]颗粒细胞中能表达FSHR蛋白，该蛋白可与FSHR抗体特异性结合，在荧光二抗孵育后可观测到FITC荧光。免疫荧光鉴定结果表明，分离培养的细胞为颗粒细胞。
[0101]实施例1得到的蛋鸭3?5mm卵泡颗粒细胞免疫荧光FITC鉴定结果如图3所示。
[0102]实施例2得到的蛋鸭6?8mm卵泡颗粒细胞免疫荧光FITC鉴定结果如图4所示。
[0103]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于包括如下步骤: (1)选择160?300日龄蛋鸭，保定后对其进行颈静脉放血处死； (2)将处死鸭浸泡在新洁尔灭稀释液中I?3min，洗净，用经高温高压灭菌的纱布拭干多余新洁尔灭，转移； (3)用75%酒精喷洒鸭后，立即转移到超净台中； (4)剪开皮肤层和肌肉层，分离卵巢组织;按不同大小卵泡进行分离，放置在预冷的磷酸盐缓冲溶液中； (5)分离单个卵泡后，测量卵泡直径后分级，分别转移到PBS中； (6)选择直径在3?8mm范围内的卵泡； (7)轻轻去除卵泡外层血管与结缔组织； (8)固定卵泡后，将卵泡剪开，迅速挤压卵泡，排出卵黄，得到卵泡膜； (9)转移卵泡膜放置预冷PBS中，将卵泡膜内侧朝上，分离颗粒细胞层； (10)将混有颗粒细胞层的液体转移，剪碎，收集； (11)离心，弃上清； (12)加入酶解溶液，吹打3?6次后转移到平底玻璃消化瓶中，振荡孵育； (13)加入胎牛血清终止消化，轻轻吹打10?20次； (14)转移含有颗粒细胞的消化液过不锈钢细胞网筛，并用M199培养基冲洗网筛； (15)收集过筛细胞液，离心； (16)弃上清，加入红细胞裂解液，室温静置，离心； (17)弃上清，加入无血清M199培养基清洗细胞I?2次，离心； (18)弃上清，加入含有胎牛血清的M199培养基，悬浮颗粒细胞，使得细胞密度在IX 16?I X 17个/mL，得到颗粒细胞悬液； (19)加入颗粒细胞悬液到细胞培养皿中，培养； (20)颗粒细胞培养24小时后，换新鲜含有胎牛血清的M199培养基，贴壁细胞为蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞。2.根据权利要求1所述的蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于:步骤(2)中所述的新洁尔灭稀释液按照新洁尔灭与超纯水的体积比为1:49配制。3.根据权利要求1所述的蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于:步骤(11)中所述的离心的条件为4°C，800?100rpm离心8?12min。4.根据权利要求1所述的蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于:步骤(12)中所述的酶解溶液的配制方法是:M199培养基中，添加有5.72g/L的HEPES’l^Penicillin-Streptomycin-NeomycirKPSNMntib1tic Mixture,0.3% Π 型胶原酶。5.根据权利要求1所述的蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于:步骤(12)中所述的振荡孵育的条件为37°C，70?90rpm，振荡孵育20?25min。6.根据权利要求1所述的蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于:步骤(13)中所述的胎牛血清的终浓度达到10%。7.根据权利要求1所述的蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于:步骤(14)中所述的不锈钢细胞网筛为200目的不锈钢细胞网筛。8.根据权利要求1所述的蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于:步骤(15)N (16)和(17)中所述的离心的条件为800?100rpm，4°C离心8?12min; 步骤(16)中所述的室温静置的时间为3?8min。9.根据权利要求1所述的蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于:步骤(18)和步骤(20)中所述的含有胎牛血清的M199培养基中的胎牛血清的终浓度为5%。10.根据权利要求1所述的蛋鸭小黄卵泡颗粒细胞的分离培养方法，特征在于:步骤(19)中所述的培养是转移至恒温5 % 二氧化碳细胞培养箱37 °C或39 V培养。
【文档编号】C12N5/075GK105886460SQ201610255499
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月21日
【发明人】陈伟, 罗茜, 熊云霞, 阮栋, 王爽, 郑春田, 夏伟光
【申请人】广东省农业科学院动物科学研究所