特异结合乏氧肝癌单抗h103轻、重链可变区基因及其应用
【专利摘要】特异结合乏氧肝癌单抗H103轻、重链可变区基因及其应用，本发明涉及特异结合人肝癌乏氧表型的单克隆抗体H103的重链和轻链可变区基因和由所述基因编码的多肽，以及所述基因和多肽在制备用于精准诊断和靶向治疗乏氧肝脏肿瘤药物中的应用。本发明人采用常氧阴性扣除筛选结合乏氧阳性选择的差异淘筛技术，成功地从自建的人噬菌体单链抗体库中克隆了特异结合乏氧肝癌细胞的H103抗体轻、重链可变区基因。所得重链和轻链可变区基因可编码正确的全人源抗体可变区。基于上述已克隆到的肝癌乏氧特异结合人源单克隆抗体H103轻、重链可变区基因，可以采用基因工程方法，构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、嵌合抗体、Fab抗体等，以便用于乏氧表型肝脏肿瘤的精准诊断和靶向治疗目的。
【专利说明】
特异结合乏氧肝癌单抗H103轻、重链可变区基因及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及特异结合乏氧肝癌细胞的单克隆抗体H103重链和轻链可变区基因和 由所述基因编码的多肽，以及所述基因和多肽在制备用于乏氧肝脏肿瘤诊断和靶向治疗中 的应用。
【背景技术】
[0002] 肝癌是我国和东南亚地区的多发病和常见病。尤其在我国，每年约有13万人死于 此病，约占全世界每年肝癌总死亡人数的42%。近年来，肝癌在我国的发病率还有逐渐增高 的趋势。肝癌具有起病隐匿、潜伏期长、高度恶性、进展快、侵袭性强、易复发转移、预后差等 特点，肝癌的早期诊断和临床治疗疗效均不是十分理想。
[0003] 肿瘤休眠细胞激活是导致肝癌复发和转移的主要根源。肿瘤休眠现象在临床上非 常普遍，许多休眠的原发癌或转移癌灶常常表现为癌组织或细胞不同程度的乏氧特点。对 于肝癌患者而言，许多人在原发肝癌切除几个月甚至几周内，整个肝脏、肺或骨骼多处出现 微/小转移灶。这种休眠的肿瘤细胞被激活后快速增殖，从而导致复发和转移、病情迅速恶 化。因此，临床处理原发肝癌时，不应只考虑传统的诊断和治疗方案，还要从癌细胞乏氧的 特点考虑对微/小转移灶休眠肝癌细胞的精准检测和靶向治疗。问题的关键在于，肿瘤休眠 细胞是一群数量极少且难以检测的静止细胞，迄今为止，国内外尚缺乏一种特异的细胞表 面标志分子可以将肿瘤休眠细胞与快速增殖的肿瘤细胞或正常组织细胞分离开。由于肿瘤 休眠细胞常常位于癌巢乏氧微环境中，肿瘤乏氧生物标志物的发现可定性并定量地反映体 内肿瘤休眠细胞实际存在情况，但其发现常常依赖于其特异性结合抗体的先导制备。因此， 本发明通过细胞常氧培养扣除筛选，结合乏氧培养正向筛选，从噬菌体抗体库中制备可特 异结合肝癌乏氧休眠细胞的特异性抗体。利用本项目制备的乏氧特异性抗体，不但可以解 析肝癌休眠细胞表面特异性的分子标志，还可进一步结合其它临床常规检测手段，实现精 准预测肝癌微/小转移、判断预后生存、评估临床治疗(如免疫治疗)效果及诊断微小残留病 变(MRD);另外，也可望为今后开展精准靶向肝癌休眠细胞的防复发转移治疗提供有力工 具。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的在于提供一种乏氧特异结合的单克隆抗体H103的重链和轻链 可变区基因，以便两者重组后可表达出特异性识别和结合乏氧肝癌细胞的抗体活性片段。
[0005] 本发明的另一目的在于所述基因和多肽在制备用于精准诊断和靶向治疗乏氧肝 脏肿瘤药物中的应用。
[0006] 本发明的另一目的在于所述基因和多肽在制备用于精准诊断和靶向治疗乏氧肝 脏肿瘤药物中的应用。
[0007] 根据本发明的一个方面，本发明涉及一种特异结合乏氧肝癌细胞的单克隆抗体 H103重链和轻链可变区基因（序列已提交GeneBank，序列号:KP347981.1)。本发明的肝癌乏 氧特异结合抗体H103重链和轻链可变区基因是从自己构建的全人源噬菌体抗体库中克隆 的。其中所述的重链可变区基因全长为399bp，其核苷酸序列如序列表中〈400>1所示，其编 码的氨基酸序列如序列表中〈400>3所示。所述的轻链可变区基因全长为366bp，其核苷酸序 列如序列表中〈400>2所示，其编码的氨基酸序列如序列表中〈400>4所示，两个基因重组后 可用于表达特异性识别和结合乏氧肝脏肿瘤细胞的抗体活性片段。
[0008] 根据本发明的另一个方面，本发明还涉及所述基因和多肽在制备用于精准诊断和 靶向治疗乏氧肝脏肿瘤药物中的应用。
[0009] 本发明人收集提取了9例原发性肝癌患者PMBC，利用自行设计引物队列成功扩增 出全套人抗体VH和VL可变区基因并组装成scFv抗体基因库。经过6批次电转，建立起一个人 源性免疫噬菌体单链抗体库，库容为2 X107,随机克隆质粒酶切表明其scFv基因正确插入 率为70%，随机克隆测序表明原始库中scFv抗体VH和VL对应同源胚系基因多样性较好;对 所建的原始抗体库挽救后的滴度最高可达6X 101Qpfu I/SHis-tag Western表明其具有较 好的scFv抗体呈现表达能力。挽救后噬菌体呈现抗体库经过4轮常氧阴性扣除筛选结合乏 氧阳性选择的差异淘筛后，阳性克隆乏氧肝癌细胞的结合富集率增加了约460倍，scFv插入 率最后一轮增加到98 %。流式细胞术筛查最终确定能与HCCLM3细胞(高转移潜能肝癌细胞 株)乏氧结合的阳性候选克隆有7个。其中，H103克隆株呈现最强阳性结合。H103克隆株基因 的HB2151菌表达产物经SDS-PAGE电泳表明，诱导的周质腔产物主要含27kD蛋白条带，占总 蛋白60% jestern blot分析证实该条带为带有His-tag标签的单链抗体。H103抗体克隆表 达产物经HPLC纯化后，目标抗体浓度为0.16mg/mL。流式细胞术免疫荧光检测表明H103单链 抗体可与乏氧培养的肝癌细胞HCCLM3等多种细胞株强阳性特异结合，而与常氧培养肝癌细 胞及非瘤细胞仅有痕量微弱结合。免疫组化对肝癌组织染色表明，H103单链抗体特异性地 结合在肝癌组织的乏氧癌巢区，且其结合分布主要在微血管匮乏的瘤组织处。
[0010]基于上述已克隆到的特异结合乏氧人肝癌细胞的单克隆抗体H103轻、重链可变区 基因，可以采用基因工程方法，构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、嵌合抗 体、Fab抗体等，以便用于肝癌乏氧的精准诊断和靶向治疗目的。
【附图说明】
[0011] 图1为从噬菌体抗体库中利用常氧阴性扣除筛选结合乏氧阳性选择的差异淘筛原 理示意。
[0012] 图2为鉴定自建的人源单链抗体噬菌体呈现库。其中，A为利用测序引物PCR扩增库 中随机克隆的琼脂粮电流结果，B为頂GT人IG胚系基因在线序列比对分析所构建抗体库的 轻、重链可变区基因多样性。
[0013] 图3为对所筛选的H103单链抗体的表达、纯化和乏氧结合特性鉴定。其中，A为考马 斯亮兰染色H103单链抗体在BL21(DE3)菌中原核表达产物及其亲和母纯化的结果，B为流式 细胞术分析比较H103单链抗体在不同肝癌细胞株上的常氧和乏氧结合指数。
[0014] 图4为激光共聚焦分析H103单链抗体对肝癌细胞的乏氧结合特异性。
[0015]图5为H103单链抗体在不同类型肝癌组织上免疫组化染色分析。其中，A为同型对 照单链抗体E4B7S在正常肝组织上染色，B、C、D、E、F依次为H103单链抗体在正常肝组织、低 分化、高分化、中分化及中分化周围非瘤组织染色结果。
[0016] 图6为H103单链抗体在肝癌组织不同血管分布区域的免疫组化染色分析。A和B为 低分化、C和D为中分化、E和F高分化;A、C和E为微血管丰富区，B、D和F为无微血管区。
[0017] 图7为乏氧特异结合单链抗体H103轻链可变区基因的测序图谱。
[0018]图8为乏氧特异结合单链抗体H103重链可变区基因的测序图谱。
【具体实施方式】
[0019]抗人肝癌乏氧特异结合单抗H103轻、重链可变区基因的筛选与克隆。
[0020]所用人单链抗体库为南开大学医学院张思河实验室采用传统的建库方法建立的 一个抗体多样性好，库容量高的全人源免疫型噬菌体抗体库，库中所含抗体分子亚型主要 为 IgG 和 IgM。
[0021 ]大容量人源scFv抗体库构建：
[0022]用淋巴细胞分离液提取原发性肝癌患者（未行外科手术切除或移植免疫抑制）新 鲜外周血PMBC，Trizol裂解细胞，氯仿-异丙醇-无水乙醇法提取总RNA。以反转录的cDNA为 模板，设计合成人IgG抗体胚系可变区基因全套引物并引入Sfi I、Not I酶切位点，PCR扩增 人IgG VH、VL基因库。酶切并凝胶纯化后与(Gly4Ser)3-linker基因片段经S0E-PCR组装成 ScFv基因并重组入pCANTAB 5his质粒。糖原沉淀连结产物，电转Xll-Blue感受态菌后涂 S0B-GT平板培养即得到细菌形式的人源scFv噬菌体抗体库。通过梯度稀释估算抗体库库 容，Sfi I+Not I双酶切鉴定scFv基因重组插入率，随机克隆测序后利用V-BASE数据库工具 包分析库中抗体基因家族分布多样性。
[0023]常氧扣除筛选和乏氧正向筛选：
[0024] 抗体库采取常氧扣除筛选和乏氧正向筛选交替进行:每一轮淘筛时，先加入挽救 的"input" scFv库到常氧培养HCCLM3细胞上进行扣除筛选，再将未结合的次级库加入乏氧 培养的HCCLM3肝癌细胞进行正向筛选。在确定每一轮淘筛为有效富集基础上，反复淘筛至 最终结合富集倍数超过200倍以上。整个淘筛结束后，随机挑取100个单菌落按前述方法进 行挽救、扩增并制备上清。将乏氧培养HCCLM3细胞用2XPBS/EDTA温和消化，PBS/0.5%BSA轻 洗封闭重悬，与挽救上清进行低温震荡结合后加入biotinylated anti_M13·菌体包膜蛋 白抗体和Streptavidin-Alexa Fluor 488 4°C孵育，上流式分析确定候选的阳性结合克 隆。
[0025] 乏氧特异结合scFv抗体可溶性表达及特性鉴定：
[0026]将强阳性结合克隆H103单链抗体基因克隆入pET28a质粒转化BL21(DE3)菌，划线 挑克隆后转接30°C诱导表达14h。提取细菌周质腔表达产物，HiTrap Anti-E-Tag柱亲和纯 化特异性scFv。再用HiTrap Desalting柱将更换缓冲液后，SDS-PAGE鉴定纯化制备的scFv 抗体，凝胶成像扫描分析其纯度，Bradford法测定抗体蛋白浓度。最后用4%PFA 4°C固定常 氧和乏氧培养的HCCLM3肝癌细胞，以纯化的scFv抗体为一抗，鼠抗E-Tag为二抗，FITC-山羊 抗小鼠 IgG为三抗，DAPI复染胞核做免疫荧光检测，激光共聚焦显微镜下观察拍照。免疫组 化染色采用基于单链抗体为一抗的ABC法进行，其中纯化的H103抗体稀释比为1:10,生物素 交联的抗his标签抗体稀释比为l:50，avidin DH和生物素 HRP来自Vectastain Elite ABC kit，具体操作按说明步骤进行。
[0027]乏氧特异结合H103单克隆抗体轻、重链可变区基因在制备用于精准诊断和靶向治 疗乏氧肝脏肿瘤中的应用：
[0028] 肝癌单抗应用方面的研究主要集中在（1)肝癌单抗在肝癌相关抗原研究中的应 用：单克隆抗体的发展提供了一个发现新肿瘤相关抗原或肿瘤抗原新位点的有效手段。这 些抗原可用于临床血清学检查，具有一定的诊断和评价治疗效果的意义。（2)肝癌单抗导向 药物研究：以单抗为载体的放免显像诊断、导向化疗和导向放疗近年取得了实质性进展。主 要有:①化学药物-单抗交联物;②细胞毒素-单抗交联物;③放射性核素-单抗交联物等。
[0029] 以本发明所述的轻、重链可变区基因重构成一定形式的蛋白药物，可直接用于肝 脏肿瘤的精准诊断及靶向治疗。另外，以本发明所述的轻、重链可变区基因编码的多肽及其 衍生物作为载体，交联上细胞毒性药物、毒素、放射性核素、酶和生物反应调节剂等作为导 向药物，也可用于乏氧有关疾病包括但不限于肝脏肿瘤的诊断及治疗。
[0030] 从本发明所述的轻、重链可变区基因编码的多肽出发，可重组成的多种形式的新 型抗体，主要包括但不限于下列几种形式：（1)小分子抗体。主要有由VH-CH1和VL-C1组成 Fab抗体、用一多肽(GLy4Ser) 3接头连接VH基因和VL基因而成的单链抗体、由VH和VL以非共 价键结合而成Fv片段抗体、由VH或VL-个功能结构域组成的单域抗体、由单个CDR构成的最 小识别单位等。（2)多价微型抗体。主要有双链抗体、（ScFv) 2、F1 ex微型抗体、LD微型抗体、F (ab'）2、（scFv)4等。由于有多价抗原结合位点，亲和力高，分子大小适中，既能穿透肿瘤组 织，亦在肾脏中的清除率较慢的特点而具有较高的临床应用价值。（3)双特异性抗体。是一 类具有双重特异性和双重功能的抗体，又称双功能抗体。（4)重组抗体融合蛋白。把Fab或Fv 等基因片段，与非抗体的毒素或酶等其它蛋白基因连接形成的具有把特定的生物活性导向 靶部位的一种重组蛋白。（5)重组免疫毒素。将编码抗体和毒素的基因重组而产生，特点是 高效，非特异毒性低，体内稳定性好，易穿透肿瘤及体内使用较安全。
[0031] 以上述由轻、重链可变区基因编码的多肽重组或衍生的抗体分子为载体，交联上 各种抗癌的效应物质而形成的免疫偶联物或导向药物主要有下列几种形式：（1)抗体-核素 偶联物。该偶联物可将核素有效地导向肿瘤组织局部，从而减少了因放疗外照射引起的正 常组织损伤及有关的不良反应，并可对肿瘤进行定位诊断和导向治疗。这种方法即为放射 免疫显像和放射免疫治疗。与单抗偶联的常用核素有 125I，131I，mIn，9()Y，99Tc m，188Re和186Re 等。（2)抗体-化疗药物偶联物。该偶联物能特异地导向肿瘤，可减低对正常组织的损伤，减 少化疗药物的毒副作用。常偶联的化疗药物如：烷化剂中的磷酸酰胺;抗代谢中的氨甲喋 呤、5-氟尿嘧啶;抗生素类阿霉素、表阿霉素、柔红霉素;植物类长春新碱、丝裂霉素等。（3) 抗体-毒素偶联物。该偶联物又称免疫毒素。其杀伤细胞作用强且不依赖于生物辅助机制。 其杀伤肿瘤机制与放疗，化疗不同，所以一般放疗、化疗效果差的肿瘤可用，应用前景广阔。 常用的毒素有篦麻毒素、白喉毒素、红豆毒素、肥皂草毒素、假单孢菌外毒素、链球菌溶血 素、穿孔素等。（4)抗体-生物反应调节剂(BRM)偶联物。BRM单独调节机体的免疫能力和杀伤 肿瘤细胞已取得较好的疗效。但由于其输入体内后仅有部分到达肿瘤靶部位，其杀伤作用 得不到充分发挥且有毒副作用。将BRM与单抗偶联，通过单抗携带其到达靶部位而发挥杀伤 肿瘤的作用，使这些因子的作用更强，且更加专一。常用的BRM有INF和IL-2等。（5)抗体导向 酶解前药。将抗体与药物专一性活化酶的偶联物注入体内，间隔一定时间后注入前药，使其 在肿瘤部位转化成高浓度抗癌活性药以杀伤肿瘤细胞。目前，可作为前药的有苯甲酸氢芥 的谷氨酰胺衍生物、磷酸鬼白乙叉戒、磷酸丝裂霉素、葡糖苷酸柔红霉素、阿霉素、5-氟胞嘧 啶和头孢菌素氮芥等。活化酶有羧肽酶G2、碱性磷酸酶、青霉素酰胺酶、β-内酰胺酶、胞嘧啶 脱氨酶、β-葡糖苷酶和氨基肽酶等。（6)免疫脂质体或纳米药物复合体。将MAb偶联到脂质体 的表面能充分将MAb与抗原特异性结合的导向性及脂质体能包裹大量药物的特性融为一 体，再包埋上多种纳米药物，则可提高药物靶向性和疗效。
【主权项】
1. 一种特异结合乏氧肝癌细胞的单克隆抗体H103的重链可变区基因，其具有序列表〈 400>1的序列。2. 由权利要求1基因编码的多肽产物，其具有序列表〈400>3的序列。3. -种特异结合乏氧肝癌细胞的单克隆抗体H103的轻链可变区基因，其具有序列表〈 400>2的序列。4. 由权利要求3基因编码的多肽产物，其具有序列表〈400>4的序列。5. 权利要求1或3所述的基因在制备用于精准诊断和靶向治疗乏氧肝脏肿瘤中的应用。
【文档编号】A61K51/10GK105886515SQ201610169372
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年3月24日
【发明人】张思河
【申请人】南开大学