一种利用TaqMan探针检测番石榴实蝇的方法及检测用引物和探针的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种利用TaqMan探针检测番石榴实蝇的方法，包括以下步骤：（1）设计引物和探针：上游引物序列见SEQ ID No：1，下游引物序列见SEQ ID No：2，探针序列见SEQ ID No：3；（2）采用步骤（1）设计的引物和探针进行荧光定量PCR检测。通过设计特异性引物和TaqMan探针，建立检测番石榴实蝇的方法，可快速、准确地检测出番石榴实蝇。
【专利说明】
-种利用TaqMan探针检测番石溜实蜗的方法及检测用引物和 探针
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种利用化qMan探针检测番石恼实蛹的方法 及检测用引物和探针。
【背景技术】
[0002] 番石恼实蛹Bac trocera correC ta，隶属于双翅目（DiP tera )、实蛹科 (Tephritidae)、寡髪实蛹亚科(Dacinae)、寡髪实蛹族(Dacini)，番石恼实蛹是危害番石 恼、芒果、相橘类和辣椒等多种热带与亚热带水果和蔬菜的重要害虫，主要发生在印度、泰 国、己基斯坦、尼泊尔、斯里兰卡、中国（台湾、云南)等地，是多种热带、亚热带水果和蔬菜的 重要害虫，1992年被列入《中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录》。我国每 年从东南亚疫区贸易性进口水果或进境旅客携带的水果中多次检出该种害虫，口岸检疫截 获频率较高。为保护中国的农业生产和生态安全，防止番石恼实蛹的传播，必须制定严格的 检验检疫制度和防除措施，而检测方法则是影响水果进出口贸易通关速度和时间的关键， 因此对其检测方法的研究极其重要。
[0003] 现有的检测番石恼实蛹的方法主要有W下几种：（1)形态鉴定检测：早期对番石恼 实蛹的鉴定主要应用传统的成虫形态鉴定方法，而通常口岸或其他渠道截获的大部分是幼 虫或卵，通常的做法是室内饲养获得成虫后，再进行形态鉴定，而饲养成虫需要较长的时 间，实蛹形态鉴定的周期一般情况下约需15~25天，检测周期较长，因此传统的成虫形态鉴 定并不利于口岸快速检验通关的实际需求；（2)声波检测:不同的声波频谱特征可反映各种 虫声所特有的信息，声波检测中关于器械灵敏度与抗外界噪声干扰的矛盾问题，一直成为 该技术发展的一个瓶颈；（3)分子检测:害虫的分子鉴定具有快速、准确、客观和对样品要求 低等诸多特点，可对形态鉴定起补充作用。自90年代TaqMan探针诞生W来，虽然巧光探针 (引物)不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，TaqMan探针技术仍然是许 多实验研究人员进行定量检测的首选，运主要是因为相对于SYBR巧光染料，TaqMan探针具 有序列特异性，只结合到互补区，而且巧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此 特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，TaqMan探针只要设计一条探 针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求，但检测番石恼实蛹的 l^gMan探针未见报道。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种利用化qMan探针检测番石恼实 蛹的方法及检测用引物和探针，利用该引物和探针可快速、准确地对番石恼实蛹进行检测 鉴定。
[0005] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0006] 本发明的一方面，提供一种利用化qMan探针检测番石恼实蛹的方法，包括W下步 骤：
[0007] (1)设计引物和探针：
[000引引物序列为：
[0009] 上游引物序列：5'-GCTAATTCATCTGTAGACATT-3'（沈Q ID No:l);
[0010] 下游引物序列：5'-AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3'（SEQ ID No:2);
[0011] 化9]\&111探针的序列：5,施-164〔4〔4147^16刊6刊6(：1'〔41'-8册3'。69 10齡：3); [001。 其中FAM为标记在探针5 '端的巧光集团，B册为标记在探针3 '端的巧光泽灭集团；
[0013] (2)采用步骤(1)设计的引物和探针进行巧光定量PCR检测。
[0014] 步骤（2)中巧光定量PCR检测的反应体系为10化，包括2X化qMan probe Supermix 化L，上、下游引物各0.化L，化qMan探针0.化L，DM模板0.化L，去离子水补至10化。
[001引步骤(2)中巧光定量PCR检测的反应程序为:95°C预变性10min，95°C变性10s，55.8 °C退火20s(采集巧光信号），40个循环。
[0016] 本发明的另一方面，提供一种用于检测番石恼实蛹的引物，其序列为：
[0017] 上游引物序列：5'-GCTAATTCATCTGTAGACATT-3' ；
[001 引下游引物序列：5 ' -AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3 '。
[0019] 本发明的第S方面，提供一种用于检测番石恼实蛹的TaqMan探针，其序列为：5 ' FAM-TGACACATATTATGTTGTTGCTCAT-B册3 ' ；其中FAM为标记在探针5 '端的巧光集团，B册为标 记在探针3 '端的巧光泽灭集团。
[0020] 本发明提供的一种利用化qMan探针检测番石恼实蛹的方法及检测用引物和探针， 具有W下有益效果:该引物和探针容易设计，特异性好，稳定性高，重复性强，灵敏度高，检 测方法简单有效，易操作，检测时间短，准确率高，可快速、准确地检测出番石恼实蛹。
【附图说明】
[0021 ]图1为不同退火溫度的Ct值结果图；
[0022] 图2为特异性实验扩增曲线图；
[0023] 图3为6个10倍系列稀释样品的巧光定量PCR扩增曲线；
[0024] 图4为重复性实验扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1
[00%] 1、样品模板:6份已知物种的实蛹DNA，编号分别为：1，2,3,4,5,6，样品名称分别为 枯小实蛹、番石恼实蛹、具条实蛹、南瓜实蛹、川黑实蛹和瓜实蛹，其中前五个种类由四川国 际旅行卫生保健中屯、口岸实验室提供，瓜实蛹由华南农业大学资源环境学院昆虫教研室提 供，具体见表1。
[0027]表1样品信息 「nn^Ql
[0029] 2、一种利用化qMan探针检测番石恼实蛹的方法，包括W下步骤：
[0030] (1)设计引物和探针：
[0031] 引物是根据番石恼实蛹DNA特异片段设计的：根据番石恼实蛹线粒体DNA序列 (Genebank accession number:NC_018787)，使用Beacon Desi即er 6软件设计其引物和探 针序列，并将设计的引物和探针在NCBI Blast比对，确认为番石恼实蛹特异性序列；
[0032]引物序列为：
[0033] 上游引物序列：5'-GCTAATTCATCTGTAGACATT-3' ；
[0034] 下游引物序列：5 ' -AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3 ' ；
[0035] l^gMan探针的序列：5 'FAM-TGACACATATTATGTTGTTGCTCAT-B册3 ' ；
[0036] 其中FAM为标记在探针5'端的巧光集团，B册为标记在探针3'端的巧光泽灭集团；
[0037] (2)采用步骤(1)设计的引物和探针进行巧光定量PCR检测:反应体系为10化，包括 2Xl'aqMan probe Supermix化L，上、下游引物各0.化L(引物终浓度分别为200nmol/L)， 化qMan探针0.化L(探针终浓度为lOOnmol/L)，DNA模板0.扣L，去离子水补至10化;反应程序 为:95°C预变性10min，95°C变性10s，合适溫度退火20s(采集巧光信号），40个循环。
[0038] 实施例2巧光定量PCR实验中退火溫度的优化
[0039] 选取的退火溫度分别为：55.8 °C、56.8 °C、57.8 °C、58.8 °C，观察其差异，不同的退 火溫度，其循环阔值(Ct)结果见表2和图1。
[0040] 表2不同退火溫度时的ct值 「00411
[0042] 由结果可知，同一浓度的番石恼实绳DNA模板在不同的退火溫度下，其循环阔值 (Ct)不同，退火溫度为55.8°C时，循环阔值最小，因此，最优的退火溫度为55.8°C。
[0043] 实施例3特异性和敏感性实验
[0044] 特异性实验：W番石恼实蛹DNA模板为阳性对照，W实施例1中的检测方法结合实 施例2中退火溫度，对6个样品的DNA模板进行巧光定量PCR检测，检测结果见图2;
[0045] 由图2可知，仅有番石恼实蛹出现了特异性扩增，其余5种实绳并没有出现扩增，说 明该检测方法特异性良好。
[0046] 敏感性实验:将番石恼实蛹DNA(原浓度为lOOng/化)进行10倍系列稀释，稀释6次， 每个稀释样品取化L作为模板进行巧光定量PCR检测，检测结果见表3和图3。
[0047] 表3 10倍系列稀释样品检测结果 r00481 LUUAV」 a模恢浓巧仕U.UUl-lUUng/化町，巧和化的(Jt但々良巧的和天巧，和天《数刃 0.999，可信度为0.99973，结果表明，TaqMan探针可对DNA浓度>0 . OOlng/化的番石恼实蛹 进行精确定量。
[(K)加]实施例4重复性实验
[0051]为检测化qMan探针定量的重复性和稳定性，对同一浓度（lO.SngAiL)的10个番石 恼实蛹DNA模板进行重复性实验，其Ct值结果见表4和图4。
[0化2]
[0053]~重复性扩增曲线显示该方法重复性好，由统计结果可知，10个模板的重复性实验胃 标准差为0.37,表明该方法重复性良好而且稳定。
[0化5]
2-)
【主权项】
1. 一种利用TaqMan探针检测番石榴实蝇的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 设计引物和探针： 引物序列为： 上游引物序列：5 ' -GCTAATTCATCTGTAGACATT-3 ' ； 下游引物序列：5 ' -AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3 ' ； TaqMan探针的序列：5 'FAM-TGACACATATTATGTTGTTGCTCAT-BHQ3 ' ； 其中FAM为标记在探针5'端的荧光集团，BHQ为标记在探针3'端的荧光淬灭集团； (2) 采用步骤(1)设计的引物和探针进行荧光定量PCR检测。2. 根据权利要求1所述的利用TaqMan探针检测番石榴实蝇的方法，其特征在于，步骤 (2)中所述焚光定量PCR检测的反应体系为10yL，包括2XTaqMan probe Supermix 5yL，上、 下游引物各〇. 4μ L，TaqMan探针0.2μ L，DNA模板0.5yL，去离子水补至10yL。3. 根据权利要求1或2所述的利用TaqMan探针检测番石榴实蝇的方法，其特征在于，步 骤(2)中所述荧光定量PCR检测的反应程序为:95°C预变性10min，95°C变性10s，55.8°C退火 20s采集荧光信号，40个循环。4. 一种用于检测番石榴实蝇的引物，其特征在于，序列为： 上游引物序列：5 ' -GCTAATTCATCTGTAGACATT-3 ' ； 下游引物序列：5 ' -AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3 '。5. -种用于检测番石榴实蝇的TaqMan探针，其特征在于，序列为：5' FAM-TGACACATATTATGTTGTTGCTCAT-BHQ3 ' ；其中FAM为标记在探针5 '端的荧光集团，BHQ为标记在 探针3'端的荧光淬灭集团。
【文档编号】C12N15/11GK106048018SQ201610407764
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】赵锋, 钟玮, 邓晓东, 刘杨, 高国龙, 田绿波
【申请人】四川国际旅行卫生保健中心